[发明专利]一种用毛细管电泳快速检测生物样本中儿茶酚氧甲基转移酶COMT活性的方法

权利要求书

1.一种用毛细管电泳快速检测生物样本中儿茶酚氧甲基转移酶COMT活性的方法，其特征在于步骤为：

（1）毛细管选择及预处理：

选用未涂层的45cm×50μm石英毛细管柱；新毛细管柱先依次用甲醇冲洗10min，蒸馏水冲洗5min，1M NaOH溶液冲洗30min，蒸馏水冲洗5min，最后再用运行缓冲液冲洗15min；进样前依次用蒸馏水及运行缓冲液各冲洗2min；

运行缓冲液为：200mmol/L PBS体积百分60%+75 mmol/L硼酸体积百分40%的缓冲体系，pH=10，含缓冲体系体积百分0.05%三氟乙酸；

（2）毛细管电泳分析条件：

检测波长为350nm，进样方式为0.5psi压力进样，进样时间10.0s，分离电压为25kV，毛细管柱温25℃；

（3）标准曲线的建立：

标准溶液的配制：精密称取对照品3,4-二羟基苯甲酸0.005g，溶于5mL 50mM PBS缓冲液配成1mg/mL的储备液，用该缓冲液稀释成25、50、100、150、200μg/mL的3,4-二羟基苯甲酸标准溶液进样，每个样品重复3次，以峰面积对浓度进行线性回归，结果在25-200μg/mL的范围内线性关系良好，回归方程为Y=166111x+11747，相关系数r²=0.9951，在25～200μg/mL浓度范围内呈良好的线性关系，最低检出浓度为0.02~0.5μM，S/N≥3；

（4）脑组织COMT酶活性测定

（4.1）样品的制备：

脑组织处理：

脑组织精密称重，加入组织裂解液，脑组织重量:组织裂解液=1g:7.5mL，匀浆，4℃14000g离心15min，取上清液A；上清液A再14000g离心15min，取二次离心后上清液B，上清液B于-80℃冰箱保留；组织裂解液为含0.6M 高氯酸PCA和0.5mM EDTA二钠，即16.6mL PCA和0.092g EDTA二钠溶于500mL水配制而成；

测试前先低温解冻上清液B，再加入等体积的含1.2M K₂HPO₄和2mM EDTA二钠的溶液，称为PCA沉淀剂，用于沉淀反应剩余的PCA，冰浴中放置10min后4℃14000g离心15min，取上清液C，即COMT酶液；之后进行酶反应体系孵育；

（4.2）酶反应体系制备：

2mM氯化镁100μL +0.2mM SAM 100μL+0.2mM 3,4-二羟基苯甲酸150μL+最后离心出来的上清液C 150μL，反应体系总体积为500μL，漩涡振荡后于37℃孵育60min；之后加入80μL冰冷2M PCA终止反应，16000g离心15min为上清液D，取上清液D为待测物；

按步骤（1）所述毛细管电泳分析条件进样，所得峰面积代入标准曲线回归方程计算得到反应剩余3,4-二羟基苯甲酸的浓度，计算单位时间内转化为3-羟基4-甲氧基-苯甲酸，即为COMT活性：

X_COMT活性=(                                                )×1000，μM/g.min，

C₀为3,4-二羟基苯甲酸起始浓度，C为反应剩余3,4-二羟基苯甲酸浓度，t_min为反应孵育时间min，G为脑组织重量g。