[发明专利]检测大鼠毛发状梭菌的试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测大鼠毛发状梭菌的方法，尤其涉及一种检测大鼠毛发状梭菌的荧光定量PCR试剂盒及方法。

背景技术

泰泽菌是由毛发样芽孢杆菌引起，以感染小鼠、大鼠、豚鼠、沙鼠、仓鼠、家兔等实验动物为主的细菌性疾病，该细菌可形成芽孢，与其它芽孢杆菌不同的是感染细胞后从繁殖菌体转变成芽孢是在细胞内完成的，感染可造成实验动物动物肝脏水肿、出血和坏死，引起实验动物剧烈腹泻和出血性肠炎等病理损害，严重影响实验动物的健康和质量，严重干扰动物实验的结果。目前该菌的实验室诊断主要依赖病理学、免疫荧光、ELISA等试验，但该细菌抗体反应不强，同时该菌人工培养不易，仅在高度分化的细胞如肝细胞中可以有生长，该细菌又是SPF级动物要求排除的细菌种类之一，这就给实验动物质量控制的病原诊断提出了新的挑战。。

根据GB14926-2001，GB18448-2001对实验动物的质量检测采用的方法基本是直接分离培养病原菌，或用ELISA（酶联免疫），IEA（免疫酶）、IFA（免疫荧光）、HAI（血凝抑制）、HI（血凝）、IH（免疫组化法）等间接检测方法^[1]。传统的方法虽然可靠，但检测灵敏度低，耗时长，往往需要几天甚至几周的时间才能获得结果，且微生物的表型会易受环境的影响，从而给鉴定带来困难，通常一次只能检测一类或少数几类病原，且都要分扩增（培养）与检测二个阶段进行，快速检测的技术已成为我国实验动物质量检测的瓶颈。近年来PCR技术在病原诊断中得到广泛应用，根据该病菌所携带的特异性功能基因设计引物，利用荧光定量PCR方法进行病原检测已逐渐被认可，有许多应用实例。荧光定量PCR反应的主要工作原理是，在反应体系加入过量的SYBR荧光染料，SYBR荧光染料可以特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不发射荧光产，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种检测大鼠毛发状梭菌的试剂盒及其检测方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种检测大鼠毛发状梭菌的试剂盒，包括10×Taqman PCR缓冲液、50μmol·L^-1的上游引物CPF的水溶液、50umol·L^-1的下游引物CPR的水溶液、dNTP mixture、25mmol·L^-1的MgCl₂水溶液、5U·L^-1的Taq DNA聚合酶水溶液、标准阳性模板、20×SYRB Green荧光染料和无菌双蒸水；所述上游引物CPF的序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物CPR的序列如SEQ ID NO.2所示；所述标准阳性模板为大鼠毛发状梭菌DNA。

一种检测大鼠毛发状梭菌的方法，该方法为用上述试剂盒对大鼠毛发状梭菌进行荧光定量PCR检测。

进一步地，所述荧光定量PCR检测方法的反应体系为：2μL的10×Taqman PCR缓冲液；1μL浓度为50μmol·L^-1的上游引物CPF的水溶液；1μL浓度为50umol·L^-1的下游引物CPR的水溶液；0.8μL的dNTP mixture；1.8μL溶度为25mmol·L^-1 的MgCl₂水溶液；0.20 μL浓度为5U·L^-1的Taq DNA聚合酶水溶液；1μL标准阳性模板或待测样品；0.4μL的20× SYRB Green荧光染料；其余为无菌双蒸水，体系的总体积为20μL；所述PCR反应程序如下：95℃变性5min，94℃预变性30s，58℃退火30s，72℃度延伸45s，循环35次，最后72℃度延伸5min。

与现存的技术相比，本发明的有益效果是：传统的方法虽然可靠，但检测灵敏度低，耗时长，往往需要几天甚至几周的时间才能获得结果，且本试验所检测的细菌只能在肝细胞等高度分化的细胞中生长，普通环境不易培养，从而给鉴定带来困难，本试剂盒提供的快速检测技术无需要进行微生物培养、扩增与检测同步进行，具有操作简便、快速、特异性好、灵敏度高等特点，可以替代分离培养等传统诊断方法，可用于实验动物检质量控制。

附图说明

图1为将本发明试剂盒标准阳性模板(泰泽氏菌DNA)梯度稀释后，进行荧光定量PCR扩增所得的动力曲线图，横坐标代表循环数，纵坐标代表相对荧光强度，平行于横坐标的直线代表阈值。