[发明专利]一种检测革兰氏阴性菌信号分子的磁性分子印迹传感器

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测革兰氏阴性菌信号分子的磁性分子印迹传感器，属于致病菌快速检测技术领域。

背景技术

食品中的肠道致病菌，是引起人类食源性疾病的主要原因之一，是人类健康的一大杀手。熟肉类食品、面包糕点，极易直接引起食源性疾病，而水产类食品，因受到水中各种微生物的污染和侵袭，也是引起人类食源性疾病的一大隐患。食品中的肠道菌多属于革兰氏阴性菌(Gram-negative)，最常见的有沙门菌、志贺菌、致泻性大肠埃希菌、产气夹膜杆菌和副溶血性弧菌等。革兰氏阴性菌，泛指革兰氏染色反应呈红色的细菌。它们产生内毒素，靠内毒素使人致病。

而预防致病菌的危害，首要条件是能够快速准确地检测出食品是否受产致病菌的污染。目前，致病菌的检测方法主要包括传统的检测方法、酶联免疫吸附试验(ELISA)、PCR及RT-PCR技术、DNA探针技术等。传统的检测方法包括增菌培养筛选及后续计数检测、生化反应鉴定或血清学鉴定等环节，这些传统方法技术成熟、准确性高、所需设备简单，但实验操作繁琐，检测周期长，准备和收尾工作繁重、特异性不足、灵敏度低，而且需要专业操作人员等。ELISA需要特殊的仪器设备，检测步骤较为繁琐、费用高、检测时间长，且易出现假阳性。多重PCR、实时荧光定量PCR的分子水平的检测方法的发展虽然比传统方法具有优越性，但所需仪器设备昂贵、检测过程复杂、成本较高、对检测环境和操作人员专业技术要求较高、所使用的试剂对人体和环境均有较大的危害，且由于产毒基因的复杂性使此方法特异性欠佳。DNA探针技术快速、灵敏度高，但是该技术存在一定的局限性：第一，经过食物加工已经死亡的细菌或亚致死细菌，其DNA仍可能存在并被检测到，但这并不表明一定有活的致病微生物在；第二，有些致病菌引起的食物中毒是由于摄取了细菌产生的毒素所造成的，因此针对毒素基因的DNA探针或PCR方法得到的阳性结果也只表示带有这些基因序列的致病微生物存在，存在潜在产毒可能性，但并不代表一定有活的细胞存在、或基因已被表达、或已经产生了毒素。

因此建立一种有效、灵敏、快速、简便、特异性高且经济的检测方法是生产经营企业、质控人员、进出口检商、政府管理部门的迫切需要和食品、环境安全的有力保障。

本发明的磁性分子印迹电化学传感器是将表面分子印迹技术、磁分离技术和电化学传感技术相结合而构建的一类新型传感器。细菌群体感应(Quorum sensing，QS)是指细菌之间通过产生、释放并感知信号分子，从而进行细菌信息交流的现象。革兰氏阴性细菌的群体感应系统利用N-酰基高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactone，AHL)作为主要信号分子诱导致病因子表达，造成细菌性病害。随着对群体感应系统系统研究的深入，已经证实该信号系统在调控革兰氏阴性菌各种毒力因子表达中起重要作用。近年来更有研究提示密度感知系统本身就可能是一种毒力因子，并且可以直接作用于宿主细胞，抑制宿主免疫反应，从而导致机体更易于被感染。因此利用检测信号分子达到间接检测致病菌的目的，使得对致病菌的检测更加准确无误。由于信号分子的浓度极低，一般手段无法检测出来。目前国内外检测信号分子AHL的方法通常有4种：①理化手段，主要通过高效液相色谱(HPLC)、气质联用(GC－MS)技术检测纯化来自液体培养基的标本，该方法除能定量外还能鉴定AHL的性质；②利用传感菌的生物学方法，即AHL产生菌诱导细菌生物感应器产生特征性的表型变化来检测AHL的存在，如紫色的产生和β-半乳糖苷酶的大量表达等。但不同的细菌生物感应器对不同酰基侧链长度的AHL敏感性不同，例如根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)对酰基侧链C-3羰基取代的AHL敏感性最强，而紫色杆菌(Chromobacterium violaceum)对短链的C-3没有取代基的AHL比较敏感，由此可见一种细菌生物感应器不能检测所有的AHL分子。其次，报告菌的检测灵敏度还受报告菌本身状态的影响；③结合物理化学手段和生物发光的薄层层析；④利用免疫学方法，合成AHL半抗原衍生物和全抗原，制备AHL相应抗体，建立AHL免疫检测新方法。不同细菌产生不同的AHL信号分子(包括C4-HSL、C6-HSL、C10-HSL、C12-HSL、C14-HSL等)，但它们具有共同的典型特征，即含有保守的高丝氨酸内酯环，因此可用其结构类似物呋喃酮制备分子印迹聚合物。分子印迹聚合物作为一种具有较高富集分离能力和特异性识别能力的材料，本发明将其应用于革兰氏阴性菌群体感应信号分子检测中，不仅检测速度比较快，并且检测结果的准确度也比较高，结合电化学还可提高检测的灵敏度。