[发明专利]用于IGF-Ⅰ化学发光免疫检测的酸性处理剂、样本预处理方法、试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及体外诊断检测技术领域，特别是涉及一种用于IGF-Ⅰ(胰岛素样生长因子Ⅰ)化学发光免疫检测的酸性处理剂、样本预处理方法、试剂盒及检测方法。

背景技术

胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)是由70个氨基酸组成的具有内分泌、自分泌及旁分泌特性的单链多肽，分子量约为7.5KU，主要由肝细胞合成和分泌，对机体生长发育起着重要调节作用。人体内多个组织和脏器都表达IGF-Ⅰ基因，局部组织IGF-Ⅰ以自分泌或旁分泌形式产生。它与胰岛素样生长因子-Ⅱ和胰岛素具有结构同源性。血液循环中的胰岛素样生长因子-Ⅰ与胰岛素样生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3)和酸性不稳定亚基相结合，主要以高分子三体聚合物的形式存在。

在人体内，生长激素(GH)和营养物的摄入对胰岛素样生长因子-Ⅰ的合成起刺激作用。刚出生时血浆中几乎检测不到胰岛素样生长因子-Ⅰ，儿童期逐步增加，青春期达到峰值，直到40岁左右开始逐渐下降。女性在怀孕时血浆胰岛素样生长因子-Ⅰ水平也有所升高。在诊断生长紊乱时，胰岛素样生长因子-Ⅰ可作为生长激素分泌的标志物。血浆或血清胰岛素样生长因子-Ⅰ浓度正常，可以作为排除生长激素缺乏的有力证据。胰岛素样生长因子-Ⅰ水平偏低提示生长激素缺乏，需作其他检查来明确是否存在生长激素分泌异常。胰岛素样生长因子-Ⅰ测量也可用作营养状况的改变。因为酸性不稳定组分和结合蛋白的存在，使得样本胰岛素样生长因子-Ⅰ测量变得复杂。酸处理对于释放胰岛素样生长因子-Ⅰ是必需的，以保证准确定量。

胰岛素样生长因子-Ⅰ在临床检测中已逐渐被广泛应用。目前市场上主要的检测方法有：放射免疫分析法(RIA)、酶联免疫吸附试验法(ELISA)、化学发光免疫分析法(CLIA)。

其中，放射免疫分析法(RIA)是利用放射性核素的测量方法与免疫反应的基本原理相结合的一种放射性核素体外检测法。主要原理为加入定量的¹²⁵I标记IGF-Ⅰ(*Ag)与样本中的未标记IGF-Ⅰ(即待测抗原)竞争性结合定量的IGF-Ⅰ抗体(Ab)。如果实验结果所计量到的结合物(*Ag-Ab)放射活性越高，表示待测物的IGF-Ⅰ浓度越低。如果所计量到的结合物放射活性越低，则表示待测物的浓度越高。藉由标准曲线图的分析，可以推算出待测物的浓度。

酶联免疫吸附试验法(ELISA)是指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体结合专一性进行免疫反应的定性和定量检测方法。主要原理为让IGF-Ⅰ抗体与酶复合物结合，然后通过显色来检测。主要方法为用纯化的人胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)，再与辣根过氧化物酶(HRP)标记的胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样本中的胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，通过标准曲线计算样本中人胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)浓度。

化学发光免疫分析法(CLIA)是利用化学或生物发光系统作为抗原抗体反应的指示系统，借以定量检测抗原或抗体的方法，发光物质可直接作为抗原抗体的标记物，也可以游离形式用于催化剂(酶)和辅助剂标记的抗原或抗体的发光反应中。主要原理为采用针对IGF-Ⅰ的一株单克隆抗体标记上标记示踪物，另一株单克隆抗体包被微球。标本、校准品与发光物标记的抗IGF-Ⅰ单克隆抗体2，微球包被的抗IGF-Ⅰ抗体1混匀，形成免疫复合物，外加磁场沉淀，去掉上清液，用洗液清洗沉淀复合物3次，直接进入标本测量室，仪器自动泵入化学发光激发物1和2，自动监测3秒钟内发出的相对光强度(RLU)。IGF-Ⅰ浓度与RLU成一定的比例关系，测定仪自动拟合计算IGF-Ⅰ浓度。

以上方法中，目前临床上使用最多也最简单快捷的是化学发光免疫分析法。市场流通的主要生产厂家有西门子和Liasion。两厂家在方法学设置上基本一致，均为一株针对IGF-Ⅰ的单克隆抗体标记发光物，另一株针对IGF-Ⅰ的单克隆抗体包被固相载体。在检测时，需要将样本加入一定比例酸性处理剂进行自动预稀释处理后，方可上机检测(其中，西门子的检测试剂盒中自动预稀释比例为1:10，Liasion的检测试剂盒中自动预稀释比例为1:20)。