[发明专利]一种鸭的TLR3基因的荧光定量PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种鸭的TLR3基因的荧光定量PCR检测方法，属生命科学领域。

背景技术

Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是一类进化上保守的Ⅰ型跨膜受体，包括富含亮氨酸(Leucine Rich Repeats，LRRs)的胞外区、跨膜区和胞内TIR区(Toll/interleukin-1receptor)。作为先天性免疫在防御微生物感染的第一道防线，TLRs在检测病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)方面起重要作用，最终激活适应性免疫应答。TLR3可识别双链RNA(dsRNA)，通过非MyD88依赖的信号通路途径，结合TRIF介导下游信号转导，激活IRF-3和核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)，刺激诱导大量IFN-α/β及其他细胞因子的表达，分泌的干扰素能够抑制病毒的复制，从而达到抗病毒功能。

相对于哺乳动物的Toll样受体，禽类的Toll样受体研究较为缓慢，目前关于鸭TLR3研究，Jiao等对番鸭TLR3有报道。传统的RT-PCR是半定量方法，在检测基因表达量方面精确度不高。Yulin Qi等运用半定量的方法检测鹅TLR3的组织分布，用β-actin作为对照发现法氏囊的表达量最高。Guo等建立了半定量RT-PCR方法来检测TLRs在牛单核细胞和单核巨噬细胞中的分布和表达规律。以上方法要么检测物种宽泛，要么检测敏感性不高。国内尚未见有关应用荧光定量PCR技术检测北京鸭TLR3的方法报道，并且本实验首次从鸭外周血单核细胞中克隆了北京鸭的TLR3基因。为研究鸭的TLR3在鸭发病过程中作用及表达水平变化，急需建立一种有效的检测方法。本实验建立的方法具有高敏感性、高特异性，高稳定性，且相比TaqMan探针法来说，价格便宜，灵敏度也较探针法高(见附图6)。本实验建立的方法可应用于分子生物学和生命科学研究领域。目前将荧光定量PCR方法应用于检测北京鸭TLR3基因的方法未见有报道。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种鸭的TLR3基因的荧光定量PCR检测方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明提供一种用于鸭的TLR3基因的荧光定量PCR检测的重组质粒pEASY-T5-zero-TLR3。

优选地，所述重组质粒的标准品的纯度：OD_260/280值为1.8～2.0；低于该1.8说明标准品有蛋白污染，高于2.0说明存在DNA存在降解现象。

优选地，所述重组质粒pEASY-T5-zero-TLR3的构建是将TLR3基因PCR扩增产物克隆于pEASY-T5-Zero载体中实现的。

第二方面，本发明提供一种用于鸭的TLR3基因的荧光定量PCR检测的引物，所述引物的序列如SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示。

SEQ ID No.3引物大小为20bp，结合于鸭TLR3开放阅读框的201位到220位；

SEQ ID No.4引物大小为20bp，结合于鸭TLR3开放阅读框的420位到439位。

第三方面，本发明提供一种鸭的TLR3基因的荧光定量PCR检测方法，所述检测方法包括如下步骤：

步骤一、荧光定量PCR反应体系及条件的优化：以所述重组质粒pEASY-T5-zero-TLR3为模板，采用矩阵法筛选所述引物的最佳浓度，并对荧光定量PCR反应体系及反应条件进行优化；

步骤二、TLR3标准曲线的建立：以重组质粒pEASY-T5-duTLR3为标准品，测定其OD₂₆₀值；根据所述标准品的分子量与质量浓度，计算其拷贝浓度，稀释，进行FQ-PCR扩增，以重组质粒pEASY-T5-duTLR3拷贝数的对数为X轴，循环次数(Ct)为Y轴，建立标准曲线；

步骤三、重复性验证：对1.0×10³～10⁸拷贝/μL的重组质粒pEASY-T5-TLR3进行重复验证，每次重复设若干浓度梯度，每个浓度梯度设有若干平行处理；

步骤四、敏感性验证：以重组质粒pEASY-T5-TLR3为模板进行FQ-PCR检测，同时设立阴性对照(NTC)；

步骤五、特异性验证：通过样品与所述标准品的序列比对及样品的溶解曲线的峰型对检测方法的特异性进行双重验证。