[发明专利]一种鸭的TLR3基因的荧光定量PCR检测方法

权利要求书

1.一种用于鸭的TLR3基因的荧光定量PCR检测的重组质粒pEASY-T5-zero-TLR3。

2.一种用于鸭的TLR3基因的荧光定量PCR检测的引物，其特征在于，所述引物的序列如SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示。

3.一种鸭的TLR3基因的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：

步骤一、荧光定量PCR反应体系及条件的优化：以所述重组质粒pEASY-T5-zero-TLR3为模板，采用矩阵法筛选所述引物的最佳浓度，并对荧光定量PCR反应体系及反应条件进行优化；

步骤二、TLR3标准曲线的建立：以重组质粒pEASY-T5-duTLR3为标准品，测定其OD₂₆₀值；根据所述标准品的分子量与质量浓度，计算其拷贝浓度，稀释，进行FQ-PCR扩增，以重组质粒pEASY-T5-duTLR3拷贝数的对数为X轴，循环次数为Y轴，建立标准曲线；

步骤三、重复性验证：对1.0×10³～10⁸拷贝/μL的重组质粒pEASY-T5-duTLR3进行重复验证，每次重复设若干浓度梯度，每个浓度梯度设有若干平行处理；

步骤四、敏感性验证：以重组质粒pEASY-T5-duTLR3为模板进行FQ-PCR检测；

步骤五、特异性验证：通过样品与所述标准品的序列比对及样品的溶解曲线的峰型对检测方法的特异性进行双重验证。

4.根据权利要求3所述的鸭的TLR3基因的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，步骤一中，所述荧光定量PCR反应体系为20μl，其中qPCR Master Mix 10μL，P3、P4分别1μL，终浓度各为0.5μM，cDNA模板2μL，去离子水补足至20μL。

5.根据权利要求3所述的鸭的TLR3基因的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，步骤一中，所述反应条件为采用两步法PCR：预变性95℃2min；95℃15s、60℃1min，40个循环；溶解曲线条件：95℃15s；60℃15s；梯度递增升温至95℃，20min；95℃15s。

6.根据权利要求3所述的鸭的TLR3基因的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，步骤二中，所述FQ-PCR扩增的模板浓度为1.0×10²～1.0×10⁸拷贝/μL。

7.根据权利要求3所述的鸭的TLR3基因的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，步骤二中，所述FQ-PCR扩增的模板量为1.0×10²～1.0×10⁸拷贝。

8.根据权利要求3所述的鸭的TLR3基因的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，步骤四中，所述重组质粒pEASY-T5-duTLR3的浓度为1.0×10¹～1.0×10⁵拷贝/μL。

9.根据权利要求3所述的鸭的TLR3基因的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，步骤五中，所述样品选自鸭的肝、心、脾、肺、肾、食道、气管、腺胃、肌胃、胰腺、十二指肠、空肠、盲肠、法氏囊、胸腺、哈氏腺、脑、皮肤、肌肉以及骨髓。

10.根据权利要求3所述的鸭的TLR3基因的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括对样品和β-actin内参基因的循环阈值(Ct值)进行2^-ΔΔCt处理；所述样品即为步骤五中样品。