[发明专利]一种检测奶牛结核易感性的检测标靶及引物

说明书

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，涉及一种检测奶牛结核易感性的检测标靶及引物，具体涉及通过检测基因SNP位点多态性来判断奶牛对结核的易感性。

背景技术

奶牛结核病是由牛结核分支杆菌引起的重要的人畜共患的慢性消耗性传染病，曾被称为“白色瘟疫”。由于潜伏期长（1-10年）、缺乏有效的防治手段，既没有有效的疫苗预防，也没有特效的药物治疗，国内外检出结核病牛，采用的方法均是隔离、扑杀及净化，经济损失巨大，并带来严重的公共卫生安全隐患，对公共卫生安全带来极大威胁。

根据世界卫生组织及粮农组织公布，大约10%人类结核由奶牛结核传染，近年来，随着结核杆菌耐药菌株的出现，结核病在近年又死灰复燃，全球结核病每年的新增病例约8百万，每年约有300万人死于结核病，即大约每10秒钟有一个人死于结核病；中国具有远高于世界平均水平的结核病发病率，是世界上22个结核病高负担国家之一，结核病患者数量居世界第二位。随着我国近年奶牛业的发展，奶牛结核亦有上升趋势。

由于目前对牛结核分枝杆菌的致病机理了解甚少，结核病的防控基础研究受到了严重制约，进行牛结核病抵抗力和易感性研究，筛选奶牛结核病易感高风险因子，为区分易感牛群和健康牛群，选择健康牛群有重要意义。

BoLA即牛白细胞抗原，也就是牛的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex， MHC)，又称主要组织相容性复合基因，包括一系列紧密连锁、高度多态性的基因座，与机体的免疫系统功能密切相关。BoLA-DRB3.2基因是牛白细胞抗原基因的外显子1，位于23号染色体上，所编码的MHC-Ⅱ分子在免疫系统中发挥着非常重要的作用。研究表明，BoLA-DRB3.2基因与家畜的抗病性和易感性有着密切的关系，且现已发现BoLA-DRB3.2基因与奶牛对乳房炎等疾病的易感性存在相关性。在对人的HLA基因与结核相关性研究发现，HLA-DRB基因与人结核病抵抗力存在极大的相关性。但是对于BoLA-DRB3.2基因与牛结核易感性相关性的研究很少，需要进一步的实验来确定。

发明内容

由于目前针对奶牛结核易感性检测的方法很少，所以寻求一种新的、有效的奶牛结合易感性的检测方法对奶牛结核病净化及健康种群培育具有很大的意义，对于这一问题，本发明提供了一对检测奶牛结核易感性的引物。

本发明采用的技术方案如下：

本发明的第一方面为提供一种用于检测奶牛结核易感性的检测标靶，即BoLA-DRB3.2基因。

本发明的第二个方面为提供一种用于检测奶牛结核易感性的引物，即以BOLA-DRB3.2基因的rs137786474号SNP位点为检测标靶，根据该SNP位点并距端点1-1000bp范围内序列设计引物，所设计引物长度为20-25bp之间，且能测定BOLA-DRB3.2基因的基因型。

所述的引物是以BOLA-DRB3.2基因的rs137786474号SNP位点为检测标靶设计的，该引物能测定BOLA-DRB3.2基因的rs137786474号SNP位点的基因型；

所述的以BoLA-DRB3.2基因r rs137786474号SNP位点为检测标靶的设计的引物是：

上游引物：5’- CTCTGTCTGTTGAGCGAAGATG-3  SEQ ID No.1；

下游引物：5’- AGTCACGCATTGACAAAATCAC-3  SEQ ID No.2；

所述以BoLA-DRB3.2基因rs137786474号SNP位点的测序引物是：

5’- CTCTGTCTGTTGAGCGAAGATG-3  SEQ ID No.1。

本发明的第三方面是将提供引物运用于奶牛结核易感性检测中。

具体包括如下步骤：

步骤（1），模板的制备：提取被测奶牛的基因组DNA；

步骤（2），引物设计：所述的引物为：

上游引物：5’- CTCTGTCTGTTGAGCGAAGATG-3；

下游引物：5’- AGTCACGCATTGACAAAATCAC-3。

步骤（3），PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测；

步骤（4），对琼脂糖凝胶电泳检测无非特异性扩增条带的PCR产物直接测序，对琼脂糖凝胶电泳检测含有非特异性条带的PCR产物测序经切胶纯化后再进行测序，根据测序结果对BOLA-DRB3.2基因的rs137786474号SNP位点的基因型进行判断；

步骤（5），判定被测奶牛患结核的风险。