[发明专利]一种检测奶牛结核易感性的检测标靶及引物

权利要求书

1.一种用于检测奶牛结核病的检测标靶，其特征在于：所述的用于检测奶牛结核病的检测标靶为BOLA-DRB3.2基因。

2.一种用于检测奶牛结核病易感性的引物，其特征在于：所述引物以BOLA-DRB3.2基因的rs137786474号SNP位点为检测标靶，根据该SNP位点并距端点1-1000bp范围内序列设计引物，所设计引物长度为20-25bp之间，且能测定BOLA-DRB3.2基因的基因型。

3.根据权利要求2所述的用于检测奶牛结核病易感性的引物，其特征在于：

所述的引物是以BOLA-DRB3.2基因的rs137786474号SNP位点为检测标靶设计的，该引物能测定BOLA-DRB3.2基因的rs137786474号SNP位点的基因型；

所述的以BOLA-DRB3.2基因rs137786474号SNP位点为检测标靶设计的引物为：

上游引物：5’- CTCTGTCTGTTGAGCGAAGATG-3；

下游引物：5’- AGTCACGCATTGACAAAATCAC-3。

4.权利要求2或3所述的引物在检测奶牛结核病易感性中的应用。

5.根据权利要求4所述的引物在检测奶牛结核病易感性中的应用，其特征在于，包括如下步骤：

步骤（1），模板的制备：提取被测奶牛的基因组DNA；

步骤（2），引物设计：所述的引物为：

上游引物：5’- CTCTGTCTGTTGAGCGAAGATG-3；

下游引物：5’- AGTCACGCATTGACAAAATCAC-3；

步骤（3），PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测；

步骤（4），对琼脂糖凝胶电泳检测无非特异性扩增条带的PCR产物直接测序，对琼脂糖凝胶电泳检测含有非特异性条带的PCR产物测序经切胶纯化后再进行测序，根据测序结果对BOLA-DRB3.2基因的rs137786474号SNP位点的基因型进行判断；

步骤（5），判定被测奶牛患结核的风险。

6.根据权利要求5所述的引物在检测奶牛结核病易感性中的应用，其特征在于，所述的PCR扩增体系为：

EasyTaq 酶，5 U/μL，0.5μl；

10×Buffer（含Mg²⁺） 5μl；

上、下游引物，10 pM，各1μl；

dNTPs，2.5 mM，4μl；

模板DNA，50 ng/μL，4μl；

ddH₂O 34.5μl；

总体积 50μl。

7.根据权利要求5所述的引物在检测奶牛结核病易感性中的应用，其特征在于，所述的PCR扩增程序为95℃预变性3min，95℃变性45s，58℃退火45s，72℃延生1min，变性-退火-延生进行35个循环，72℃再延伸8min，最后4℃保存。

8.根据权利要求5所述的引物在检测奶牛结核病易感性中的应用，其特征在于，所述的步骤（3）琼脂糖凝胶电泳检测的具体方法如下：配1%（w/v）琼脂糖凝胶，取5μL扩增的产物与1μL 6xloading buffer混匀后上样，120V下电泳25min，紫外判断PCR结果，如出现一条专一性条带表示无非特异性扩增，如出现两条或以上条条带表示出现非特异性扩增。

9.根据权利要求5所述的引物在检测奶牛结核病易感性中的应用，其特征在于，所述的对BOLA-DRB3.2基因的rs137786474号SNP位点的基因型的具体判断方法为：用DNASTAR软件中SeqMan程序对序列的rs137786474号位点的碱基进行对比，得出该位点的基因型，基因型分为A/A、A/G和G/G型。

10.根据权利要求5所述的引物在检测奶牛结核病易感性中的应用，其特征在于，所述的判定被测奶牛患结核的风险的具体步骤为：BoLA-DRB3.2基因rs137786474号SNP位点的基因型为A/A基因型的牛只患结核性的风险最高，G/G基因型患结核病的风险为A/A基因型的0.5-0.55倍，A/G基因型患结核的风险最低，然后根据BoLA-DRB3.2基因rs137786474号SNP位点的基因型将牛群分类管理。