[发明专利]一种基于金杂化ZSM-5分子筛负载电子媒介体构建的三通道生物传感器的制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明一种基于金杂化ZSM-5分子筛负载电子媒介体构建的三通道生物传感器的制备方法及应用。具体是采用金杂化ZSM-5分子筛负载电子媒介体做为标记物，制备一种同步检测三个肿瘤标志物抗原的电化学免疫传感器，属于新型功能材料与生物传感检测技术领域。

背景技术

肿瘤标志物是肿瘤细胞本身存在或分泌的特异性物质，迄今所知的肿瘤标志物中，绝大多数不但存在于恶性肿瘤中，而且也存在于良性肿瘤、胚胎组织，甚至正常组织中。因此，这些肿瘤标志物并非恶性肿瘤的特异性产物，但在恶性肿瘤患者中明显增多。肿瘤的预防、诊断和治疗是目前医学领域研究的重大课题。电化学免疫传感器具有选择性好，灵敏度高，检测限低，适合联机化，操作简便等优点，可实现在线电化学检测，样品预处理简单或不需预处理，检测不受样品物理性质的影响，所需仪器设备相对简单，具有简便、快速、体积小等特点，目前已经广泛应用于肿瘤标志物的检测。因此本发明制备了一种基于金杂化的ZSM-5分子筛标记的三通道电化学免疫传感器，实现了对三个肿瘤标志物抗原的同步检测。首先，ZSM-5分子筛具有大的比表面积和良好的吸附性能，能够负载大量的电子媒介体；其次，金杂化的ZSM-5分子筛具有良好的生物相容性，能够和检测抗体有效键合；最后，中性红、甲苯胺蓝和二茂铁甲酸能够在电极表面发生氧化还原作用，产生具有不同峰位的峰电流，分别为三个肿瘤标志物抗原提供电化学信号。该方法具有成本低、灵敏度高、特异性好、快速同步检测等优点，而且制备过程较为简单，为癌症的有效预警提供了新方法。

发明内容

本发明的目的之一是基于金杂化ZSM-5分子筛负载电子媒介体，构建了一种无酶、快速且超灵敏的双通道夹心型电化学免疫传感器。

本发明的目的之二是将该三通道夹心型电化学免疫传感器应用于三个肿瘤标志物的检测。

本发明的技术方案如下：

1. 一种基于金杂化ZSM-5分子筛负载电子媒介体构建的三通道生物传感器的制备方法

（1）依次用1.0、0.3、0.05 μm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，分别在超纯水和乙醇中超声清洗，氮气吹干；

（2）在电极表面滴加6 μL浓度为1 ~ 2 mg/mL的金杂化ZSM-5分子筛的水溶液，干燥；

（3）继续将6 μL浓度为8 ~ 12 μg/mL的三个肿瘤标志物抗原的捕获抗体溶液滴加到修饰电极表面，于4℃冰箱中孵化1 h，清洗干净；

（4）用3 μL浓度为5 ~ 15 mg/mL的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，于4℃冰箱中孵化1 h，清洗干净；

（5）将6 μL浓度为0.000003 ~ 18 ng/mL的一系列不同浓度的三个肿瘤标志物抗原用于和对应的的捕获抗体的特异性识别，室温下孵化1 h，清洗干净；

（6）将6 μL浓度为1 ~ 2 mg/mL分别为金杂化ZSM-5分子筛负载中性红、金杂化ZSM-5分子筛负载甲苯胺蓝和金杂化ZSM-5分子筛负载二茂铁甲酸标记的三个肿瘤标记物的检测抗体溶液滴在电极上，与对应的三个肿瘤标记物抗原进行特异性识别，室温下孵化1 h，清洗干净，于4℃冰箱中储存备用。

2. 金杂化ZSM-5分子筛负载中性红、金杂化ZSM-5分子筛负载甲苯胺蓝和金杂化ZSM-5分子筛负载二茂铁甲酸标记的三个肿瘤标记物的检测抗体溶液的制备

（1）金杂化ZSM-5分子筛的制备

取0.5 ~ 1 gZSM-5分子筛溶于10 ~ 20 mL无水甲苯中，加入0.5 ~ 1 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷，在70℃下回流1.5 h。离心后于110℃下干燥1 h，得到粉末为氨基功能化的ZSM-5分子筛，将50 ~ 100 mg氨基化ZSM-5分子筛溶于10 mL超纯水中，在搅拌下缓缓加入到100 ~ 200 mL金纳米粒子溶液中，溶液立即变为不透明的深紫色，离心，除去上清液，在35℃下真空干燥，得到的紫色固体粉末为金杂化ZSM-5分子筛；

（2）金杂化ZSM-5分子筛负载中性红标记的肿瘤标记物的检测抗体的制备

取1 mL浓度为1 ~ 2 mg/mL的金杂化ZSM-5分子筛水溶液与1 mL浓度为10 ~ 20 μg/mL的第一种肿瘤标志物的检测抗体混合，震荡12 h，离心洗涤后，继续加入1 mL浓度为1 ~ 2 mg/mL的中性红溶液，继续震荡12 h，离心洗涤后，将沉淀物重新分散在1 mL超纯水中，制得金杂化ZSM-5分子筛负载中性红标记的肿瘤标记物的检测抗体溶液，于4℃冰箱中储存备用；