[发明专利]检测PIK3CA基因H点突变的PCR-RFLP方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测PIK3CA基因H1047R位点突变的PCR-RFLP方法。

背景技术

磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）是使磷脂酰肌醇分子中肌醇环的3位羟基磷酸化的酶，其所调控的信号通路涉及细胞增殖、粘附、生存等多种生命活动，在肿瘤发生发展中起重要作用。PIK3CA基因编码PI3K的催化亚基，可以激活PI3K通路的下游AKT途径。PIK3CA的突变与大肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌等多种肿瘤的发生密切相关。研究发现，在大肠癌中，PIK3CA的突变热点集中于E542K、E545K和H1047R。近期研究显示，位于外显子20的H1047R点突变与转移性大肠癌的抗表皮生长因子受体EGFR的靶向治疗疗效相关，携带该突变的患者无法从抗EGFR靶向治疗中获益，PIK3CA H1047R突变有可能继KRAS G12V 突变和BRAF V600E突变之后，成为大肠癌靶向治疗的又一疗效预测因子。因此，发展针对该位点的高效基因突变检测方法对于准确预测靶向治疗的适用人群，提高治疗效果，避免患者不必要的治疗费用和毒副作用，进行个体化的治疗，具有重要意义。

目前，DNA直接测序是PIK3CA基因突变检测的金标准，但该方法的检测灵敏度较低，通常只有20%-30%，难以检测出样品中低丰度的基因突变，易造成用药人群的错误分类，导致治疗无效。此外，DNA直接测序方法操作繁琐、耗时。近年，有研究建立HRM高分辨熔解曲线方法检测PIK3CA的H1047R突变，一定程度提高了检测灵敏度，但较高的检测费用和特殊的设备要求限制了其广泛的临床应用。

PCR-RFLP称为聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析，是一种成熟的基因突变检测方法。通过内切酶特异性识别并切割野生型与突变体DNA的差异碱基位点，电泳分离酶切片段，根据片段长度和数量的差异判断突变的存在，特别适合对基因点突变的检测。由于该方法特异性强，结果容易判断，操作简单，已被广泛应用。相对于DNA直接测序，该方法具有更高的检测灵敏度；相对于HRM等以峰型差异判断结果的方法，该方法具有更高的检测准确性，并且没有复杂的设备要求，检测费用相对较低，适合临床的实际应用，但目前未见采用该方法进行PIK3CA基因突变检测的报道。为此，本发明开发一种针对PIK3CA基因H1047R突变位点的PCR-RFLP检测方法，用于指导和监控肿瘤的个体化治疗。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于PIK3CA基因 H1047R位点突变的检测方法。发明要点在于针对PIK3CA基因H1047R突变位点设计一对特异性引物，引入FstⅠ限制性酶切位点，使野生型和突变型PIKACA基因片段形成差异性限制性酶切图谱，分析H1047R位点突变状态，用于指导肿瘤个体化治疗。

本发明检测PIK3CA基因H1047R位点突变的PCR-RFLP方法包括以下步骤：

1.提取待检样品的基因组DNA

2. PIK3CA基因的PCR扩增

以提取的基因组DNA为模板，使用上游引物5’-GGAGTATTTCATGAAACAA ATGAATGATGCG-3’和下游引物5’-GAGCTTTCATTTTCTCAGTTATCTT-3’，进行PCR扩增，得到126bp扩增产物，同时引入FstⅠ酶切位点；

3. FstⅠ酶切反应

以扩增得到的126bp产物为模板，使用FstⅠ内切酶进行酶切反应；

4. 电泳检测酶切片段

采用琼脂糖凝胶电泳方法分离酶切片段，获得限制性片段长度多态性图谱；

5. 突变状态结果判定

根据限制性片段的长度和数量确定待检样品的PIK3CA基因突变状态，电泳图谱在96bp和30bp位置呈现两条带者判定为PIK3CA基因野生型；电泳图谱中在126bp处呈现一条带者判定为突变型。

所述的待检样品包括细胞系、新鲜组织、石蜡切片、血液标本或粪便；所述的待检样品的基因组DNA，使用商品化的DNA提取试剂盒提取获得。

    所述的PIK3CA基因PCR扩增体系如下：

    ddH₂O              17 μL

10×buffer (含Mg²⁺)  2.5 μL

dNTP                2 μL

上游引物 (10μM)      1 μL

下游引物 (10μM)     1 μL

基因组DNA          1 μL