[发明专利]检测PIK3CA基因H点突变的PCR-RFLP方法

权利要求书

1.一种检测PIK3CA基因H1047R位点突变的PCR-RFLP方法，其特征在于包含以下步骤：

（1）提取待检样品的基因组DNA

（2）PIK3CA基因的PCR扩增

以提取的基因组DNA为模板，使用上游引物5’-GGAGTATTTCATGAAACAA ATGAATGATGCG-3’和下游引物5’-GAGCTTTCATTTTCTCAGTTATCTT-3’，进行PCR扩增，得到126bp扩增产物，同时引入FstⅠ酶切位点；

（3）FstⅠ酶切反应

以扩增得到的126bp产物为模板，使用FstⅠ内切酶进行酶切反应；

（4）电泳检测酶切片段

采用琼脂糖凝胶电泳方法分离酶切片段，获得限制性片段长度多态性图谱；

（5）突变状态结果判定

根据限制性片段的长度和数量确定待检样品的PIK3CA基因突变状态，电泳图谱在96bp和30bp位置呈现两条带者判定为PIK3CA基因野生型；电泳图谱中在126bp处呈现一条带者判定为突变型。

2. 根据权利要求1所述的检测PIK3CA基因H1047R位点突变的PCR-RFLP方法，其特征在于所述的待检样品包括细胞系、新鲜组织、石蜡切片、血液标本或粪便；所述的待检样品的基因组DNA，使用商品化的DNA提取试剂盒提取获得。

3. 根据权利要求1所述的检测PIK3CA基因H1047R位点突变的PCR-RFLP方法，其特征在于所述的PIK3CA基因的PCR扩增体系如下：

    ddH₂O              17 μL

10×buffer (含Mg²⁺)  2.5 μL

dNTP                2 μL

上游引物 (10μM)      1 μL

下游引物 (10μM)     1 μL

基因组DNA          1 μL

rTaq               0.5 μL

总体积             25 μL

所述的PCR扩增条件为：

预变性：94℃ 5 min；30个循环：变性94℃ 45 s，退火60℃ 45 s，延伸72℃ 45 s；最后延伸72℃ 5 min。

4. 根据权利要求1所述的检测PIK3CA基因H1047R位点突变的PCR-RFLP方法，其特征在于所述的FstⅠ酶切反应体系及条件如下：

ddH₂O              5 μL

10× FastDigest Buffer  1 μL

PCR 产物(200ng)     2 μL

FastDigest enzyme（FstⅠ） 2 μL

37 ℃ 孵育 10 min。

5. 根据权利要求1所述的检测PIK3CA基因H1047R位点突变的PCR-RFLP方法，其特征在于所述的电泳检测酶切片段采用琼脂糖凝胶电泳，使用3%琼脂糖凝胶，10 μL酶切产物上样，5 μL DL500 作为分子量标准对照，95V条件下进行电泳分离，EB染色，凝胶成像系统观察拍照。

6.根据权利要求1所述的检测PIK3CA基因H1047R位点突变的PCR-RFLP方法，其特征在于所述的突变状态结果判定方法为：电泳图谱在96bp和30bp位置呈现两条带者判定为PIK3CA基因野生型即含有1个FstⅠ酶切位点；电泳图谱中在126bp处呈现一条带者判定为突变型即不含FstⅠ酶切位点。