[发明专利]一种猪脂肪干细胞的分离培养方法

说明书

技术领域

本发明属于生命科学领域，具体涉及一种猪脂肪干细胞的分离培养方法。

背景技术

脂肪干细胞(Adipose-Derived Stem Cells,ADSCs)是来源于脂肪组织中的具有不断的自我更新与多向分化潜能的间充质干细胞。脂肪干细胞为成纤维细胞样,脂肪干细胞低表达HLA-ABC，而不表达HLA-DR，从而说明AMSCs具有低免疫原性，用于同种异体、异种异体移植后，均不会发生免疫排斥反应，在一定条件下，可以向脂肪细胞、软骨细胞、肌肉细胞和成骨细胞分化，脂肪干细胞的基本形态、增殖周期、免疫源性及多向分化潜能与目前研究较多的骨髓间充质干细胞相似。

ADSCs取自于脂肪组织，具有来源广泛、取材简单、培养成功率高、细胞老化率低等优点，引起研究者的广泛关注，逐渐成为组织工程学的理想种子细胞。

脂肪组织的获得方法：通常利用吸脂术获得脂肪抽提物，或者用外科手术切取的脂肪组织。动物腹股沟皮下脂肪或内脏脂肪(如：肠、肾、卵巢及睾丸等部位脂肪)一般被用于分离ADSCs。不管是人ADSCs还是动物ADSCs，通常采用胶原酶消化法分离AMSCs。不同研究小组采用不同的胶原酶类型、消化时间和消化不同部位的脂肪组织均能得到多能干细胞。现有技术获取的脂肪组织含有较多血管及血液，需要手动去除血管，只通过PBS清洗整块脂肪组织，没有清洗剪碎后的脂肪组织。脂肪组织中含有大量血液等其他杂质影响酶解效果，因此胶原酶消化脂肪组织时间过长。另外，目前分离培养脂肪干细胞的培养基通常为含胎牛血清的DMEM/F12完全培养基，而血清可能存在对细胞的毒性作用和血清源性污染。

发明内容

本发明在猪脂肪干细胞分离培养中，能够减少脂肪组织来源中血液等杂质对酶解脂肪的影响，缩短I型胶原酶酶解脂肪时间、使用无血清培养基培养原代细胞，培养基中添加合适的生长因子，能够更好地分离培养猪脂肪干细胞，保持较强的增殖生长能力，从而建立一套规范标准的猪脂肪干细胞原代分离培养的方法。

本发明目的通过以下技术方案来实现：

一种猪脂肪干细胞的分离培养方法，包括以下步骤:

(1)抽取猪皮下脂肪组织后，将脂肪组织与含双抗的PBS缓冲液混匀，静置5～10分钟，脂肪组织与PBS缓冲液分层；吸去下层PBS缓冲液与血液的混合液体，再加入含双抗的PBS缓冲液重复清洗；

(2)将清洗后的脂肪组织剪碎，去除结缔组织，再加入含双抗的PBS缓冲液混匀后，500g～700g离心3～5分钟，去除上层油脂与下层的PBS及血液，留下中层的脂肪组织；

所述含双抗的PBS缓冲液为含青霉素和链霉素的PBS缓冲液；

(3)在脂肪组织中加入Ⅰ型胶原酶消化液，震荡条件下消化45～75min；

(4)消化后，立即以1000rpm～1500rpm离心5～10min，离心后，沉淀部分即为猪脂肪干细胞；

(5)将猪脂肪干细胞用完全培养基中培养；所述完全培养基为含有EGF的无血清培养基，EGF的浓度为10ng/ml。

所述PBS缓冲液为磷酸盐缓冲液，优选所述含双抗的PBS缓冲液为含100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的PBS缓冲液。

优选，步骤(1)和步骤(2)所述含双抗的PBS缓冲液的加入量是脂肪组织体积的1～2倍。

优选，步骤(2)所述去除上层油脂与下层的PBS及血液是用10ml量程的移液管吸除脂肪组织上层油脂与下层PBS及离心管底部的血液，留下中层的脂肪组织。

优选，步骤(4)所述沉淀部分是采用10ml量程的移液管吸除离心后悬浮的脂肪细胞及脂滴，弃上清液，得到的沉淀。

步骤(5)所述将猪脂肪干细胞用完全培养基培养包括以下步骤：

(1)用PBS重悬猪脂肪干细胞，过滤获得细胞悬液，将细胞悬液以1000rpm～1500rpm离心5～10min，弃上清液加入无血清培养基，吹打均匀，按1×10⁴/cm²～2×10⁴/cm²的密度将细胞接种于培养皿中，加入完全培养基；

(2)在37℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养48h后用预温的PBS洗涤，以除去未贴壁细胞以及杂质，加入完全培养基；