[发明专利]一种猪脂肪干细胞的分离培养方法

权利要求书

1.一种猪脂肪干细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤:

(1)抽取猪皮下脂肪组织后，将脂肪组织与含双抗的PBS缓冲液混匀，静置5～10分钟，脂肪组织与PBS缓冲液分层；吸去下层PBS缓冲液与血液的混合液体，再加入含双抗的PBS缓冲液重复清洗；

(2)将清洗后的脂肪组织剪碎，去除结缔组织，再加入含双抗的PBS缓冲液混匀后，500g～700g离心3～5分钟，去除上层油脂与下层的PBS及血液，留下中层的脂肪组织；

所述含双抗的PBS缓冲液为含青霉素和链霉素的PBS缓冲液；

(3)在脂肪组织中加入Ⅰ型胶原酶消化液，震荡条件下消化45～75min；

(4)消化后，立即以1000rpm～1500rpm离心5～10min，离心后，沉淀部分即为猪脂肪干细胞；

(5)将猪脂肪干细胞用完全培养基中培养；所述完全培养基为含有EGF的无血清培养基，EGF的浓度为10ng/ml。

2.根据权利要求1所述的一种猪脂肪干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述PBS缓冲液为磷酸盐缓冲液，所述含双抗的PBS缓冲液为含100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的PBS缓冲液。

3.根据权利要求1所述的一种猪脂肪干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)所述含双抗的PBS缓冲液的加入量是脂肪组织体积的1～2倍。

4.根据权利要求1所述的一种猪脂肪干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(2)所述去除上层油脂与下层的PBS及血液是用10ml量程的移液管吸除脂肪组织上层油脂与下层PBS及离心管底部的血液，留下中层的脂肪组织。

5.根据权利要求1所述的一种猪脂肪干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(4)所述沉淀部分是采用10ml量程的移液管吸除离心后悬浮的脂肪细胞及脂滴，弃上清液，得到的沉淀。

6.根据权利要求1所述的一种猪脂肪干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(5)所述将猪脂肪干细胞用完全培养基培养包括以下步骤：

(1)用PBS重悬猪脂肪干细胞，过滤获得细胞悬液，将细胞悬液以1000rpm～1500rpm离心5～10min，弃上清液加入无血清培养基，吹打均匀，按1×10⁴/cm²～2×10⁴/cm²的密度将细胞接种于培养皿中，加入完全培养基；

(2)在37℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养48h后用预温的PBS洗涤，以除去未贴壁细胞以及杂质，加入完全培养基；

(3)每2～3d换一次培养基，待细胞融合度达到80％～90％时，用预温的PBS清洗，再用2.5mg/ml胰蛋白酶在37℃条件下消化细胞2～3min,之后用等体积的完全培养基中和，以1000rpm离心5min后，弃上清,按1×10⁴/cm²～2×10⁴/cm²接种至完全培养基中，每2～3d换一次完全培养基。

7.根据权利要求6所述的一种猪脂肪干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述过滤是过70μm的细胞筛。

8.根据权利要求6所述的一种猪脂肪干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述预温的PBS是温度在25℃～37℃的PBS。

9.根据权利要求1所述的一种猪脂肪干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述I型胶原酶的终浓度为1mg/ml。