[发明专利]用于检测青蟹双顺反子病毒-1的核酸探针、试剂盒及使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测病毒的探针，具体地说，是一种用于检测青蟹双顺反子病毒-1的特异性核酸探针、检测方法以及检测试剂盒。

背景技术

拟穴青蟹隶属梭子蟹科，青蟹属，因其肉美味鲜，含有丰富的蛋白质及微量元素，有清热解毒、补骨添髓、养筋接骨等功效，倍受人们的喜爱，成为我国东南沿海地区重要的海水养殖种类。但是随着养殖规模的逐步扩大，病害问题的出现严重影响了拟穴青蟹养殖业的健康发展。青蟹双顺反子病毒-1(Mud Crab Dicistrovirus-1，MCDV-1)是在近几年的染病青蟹体内新分离的一种病原体。感染该病毒后病蟹表现出食欲不振，活力缺乏，人工感染死亡率100％。该病毒是一种球状、无囊膜、直径30nm的单正链RNA病毒，能够通过浸泡、进食、投喂、共居的方式感染拟穴青蟹，但是至今为止，还没有有效的治疗方法，所以，杜绝传染源、防止病毒的传染和流行是能够采取的主要措施，早期快速诊断青蟹双顺反子病毒-1是减少损失的有效途径。

核酸探针分子杂交技术是利用带有标记物的已知序列的核酸片段和互补的核酸序列杂交，然后通过抗原-抗体反应和酶-底物的化学显色反应来显示结果，可用于待测核酸样品中特定基因序列的检测。将核酸探针应用于原位杂交还可以对病毒在组织内的分布进行定位，国内已经有不少学者将这项技术用于临床检测以及流行病学调查。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种用于检测青蟹双顺反子病毒-1的核酸探针，该探针能够特异性的识别该病毒的核酸序列，可以用于青蟹双顺反子病毒-1的检测。

本发明的目的还在于提供一种含有上述核酸探针的青蟹双顺反子病毒-1检测试剂盒，该试剂盒特异性好，操作简便，可以对该病毒进行检测以及组织定位。

本发明的目的还在于提供一种利用上述试剂盒检测青蟹双顺反子病毒-1的斑点杂交方法，该方法特异性好，对于设备要求不高，操作简单。

本发明的最后一个目的在于提供一种利用上述试剂盒检测青蟹双顺反子病毒-1的原位杂交检测方法，该方法操作容易，特异性好，而且可以对病毒在宿主体内的分布进行定位。

本发明的第一个目的是通过如下技术方案来实现的：

该用于检测青蟹双顺反子病毒-1的核酸探针为地高辛标记的核酸片段，该核酸片段的5’端和3’端之间的基因序列如SEQID N0.1所示。

本发明的第二个目的是通过如下技术方案来实现的：

含上述的用于检测青蟹双顺反子病毒-1的核酸探针的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒由多个试剂瓶和硝酸纤维素膜组成，所述的试剂瓶包括下述组分，用于检测青蟹双顺反子病毒-1核酸的A液，用于促进探针结合的B液，用于消化包围靶RNA蛋白质的C液，用于组织蛋白非特异结合位点封闭的D液，用于与没有杂交的探针结合的E液，用于显色的F液，用于洗去杂质的G液；

其中：所述的A液为地高辛标记的核酸探针。

上述的试剂盒，所述的B液为杂交液；所述的C液为蛋白酶K；所述的D液为10×封闭液；所述的E液为碱磷酶标记的地高辛抗体；所述的F液NBT/BCIP储液；所述的G液为TE缓冲液。

本发明的第三个目的是通过如下技术方案来实现的：

1)将NC膜用2×SSC液浸透，取出后晾干；

2)将病毒样品RNA放PCR仪中变性后，立即放入冰上；

3)将变性后的病毒RNA点样于步骤1)的NC膜上，120℃烤膜30min；

4)将步骤3)烤后的NC膜放入B液中预杂交30min；

5)用B液将A液稀释至25ng/mL后煮沸变性，立即置于冰上冷却；

6)将步骤4)预杂交好的NC膜转移到步骤5)中制备的探针杂交液中，孵育过夜；

7)将步骤6)杂交好的NC膜在室温下清洗，再用缓冲液中漂洗；

8)将D液用马来酸缓冲液稀释后制成封闭溶液工作液，将NC膜放入封闭溶液，静置；

9)用步骤8)的封闭溶液工作液将E液稀释后，制成抗体溶液工作液，然后将NC膜放入抗体溶液工作液中，静置；

10)将步骤9)的NC膜放入洗涤缓冲液中洗涤后放入检测缓冲液中平衡；

11)向F储液加入检测缓冲液中混匀制备底物显色液，然后滴加在NC膜上中避光显色过夜；显色后用G液洗NC膜，结果扫描或拍照。

本发明的第四个目的是通过如下技术方案来实现的：

用上述试剂盒检测青蟹双顺反子病毒-1的原位杂交方法，该方法依次包括下述步骤：