[发明专利]用于检测青蟹双顺反子病毒-1的核酸探针、试剂盒及使用方法

权利要求书

1.一种用于检测青蟹双顺反子病毒-1的核酸探针，其特征在于，所述的核酸探针为地高辛标记的核酸片段，该核酸片段的5’端和3’端之间的基因序列如SEQIDNo.1所示。

2.含权利要求1所述的用于检测青蟹双顺反子病毒-1的核酸探针的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒由多个试剂瓶和NC膜组成，所述的试剂瓶包括下述组分，用于检测青蟹双顺反子病毒-1核酸的A液，用于促进探针结合的B液，用于消化包围靶RNA蛋白质的C液，用于组织蛋白非特异结合位点封闭的D液，用于与没有杂交的探针结合的E液，用于显色的F液，用于洗去杂质的G液；

其中：所述的A液为地高辛标记的核酸探针。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的B液为杂交液。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的C液为蛋白酶K。

5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的D液为10×封闭液。

6.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的E液为碱磷酶标记的地高辛抗体。

7.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的F液NBT/BCIP储液。

8.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的G液为TE缓冲液。

9.用权利要求2所述的试剂盒检测青蟹双顺反子病毒-1的斑点杂交方法，其特征在于，该方法依次包括下述步骤：

1)将NC膜用2×SSC液浸透，取出后晾干；

2)将病毒样品RNA放PCR仪中变性后，立即放入冰上；

3)将变性后的病毒RNA点样于步骤1)的NC膜上，120℃烤膜30min；

4)将步骤3)烤后的NC膜放入B液中预杂交30min；

5)用B液将A液稀释至25ng/mL后煮沸变性，立即置于冰上冷却；

6)将步骤4)预杂交好的NC膜转移到步骤5)中制备的探针杂交液中，孵育过夜；

7)将步骤6)杂交好的NC膜在室温下清洗，再用缓冲液中漂洗；

8)将D液用马来酸缓冲液稀释后制成封闭溶液工作液，将NC膜放入封闭溶液，静置；

9)用步骤8)的封闭溶液工作液将E液稀释后，制成抗体溶液工作液，然后将NC膜放入抗体溶液工作液中，静置；

10)将步骤9)的NC膜放入洗涤缓冲液中洗涤后放入检测缓冲液中平衡；

11)向F储液加入检测缓冲液中混匀制备底物显色液，然后滴加在NC膜上中避光显色过夜；显色后用G液洗NC膜，结果扫描或拍照。

10.用权利要求2所述的试剂盒检测青蟹双顺反子病毒-1的原位杂交方法，其特征在于，该方法依次包括下述步骤：

1)组织切片上滴加C液，37℃消化20min；PBS漂洗后，用多聚甲醛液固定后漂洗；

2)将玻片用变性液78℃变性8min，立即放入-20℃预冷的乙醇梯度中；

3)用B液将A液稀释后滴加在步骤2)完全风干后的玻片上，杂交过夜；

4)漂洗步骤3)的玻片；

5)将D液用马来酸缓冲液稀释后制成封闭溶液工作液，滴加在步骤4)的玻片上静置；

6)用封闭溶液工作液将E液稀释，制成抗体溶液工作液，然后滴加到步骤5)处理后的玻片上，静置；

7)将步骤6)玻片放入洗涤缓冲液中漂洗后放入检测缓冲液中平衡；

8)向F液加入检测缓冲液中混匀制备底物显色液，将步骤7)的玻片放入底物显色液中避光显色；

9)用G液浸泡步骤8)的玻片后复染，再次洗涤后快速脱水透明，中性树胶封片，光镜下观察。