[发明专利]表达重组抗体CHO细胞系稳定性的早期鉴定方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，涉及一种细胞系的鉴定方法，尤其涉及一种表达重组抗体CHO细胞系稳定性的早期鉴定方法。

背景技术

流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析数万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。自70年代以来，随着流式细胞技术水平的不断提高，其应用范围也日益广泛。流式细胞术已普遍应用于免疫学、血液学、肿瘤学、细胞生物学、细胞遗传学、生物化学等临床医学和基础医学研究领域(参见：杜立颖，冯仁青.《流式细胞术》北京大学出版社.2008)。

细胞凋亡最早由Kerr在1972年根据细胞的形态学特征提出(Kerr JF,Wyllie AH,Currie AR.Apoptosis:a basis biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics.Br J Cancer,1972,26:239-257)。细胞凋亡是细胞对内外信息刺激的应答反应，且为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡，是一种生理性死亡(Physiogical cell death，PCD)(参见：张晓军,姚天明,王文亮.细胞凋亡的最新研究进展.第四军医大学学报,2002,23:42-44)。

基因重组工程细胞系已充分应用于重组蛋白体外表达领域。如重组人促红素蛋白(EPO)，重组人胰岛素(insulin)，以及各类单克隆抗体药物的生产等。重组EPO和重组人胰岛素均为原核表达，主要宿主细胞为大肠杆菌，该表达系统具有快速，高产的特点，但因为是原核细胞，生产的蛋白可能形成包涵体，需要复性，并且没有糖基化修饰，同时内毒素也是主要污染源。目前，已知的各类抗体药物，包括治疗乳腺癌的赫赛汀(Herceptin)，治疗淋巴瘤的美罗华(Rituxan)和治疗结肠癌的爱必妥(Erbitux)等，都是在CHO细胞体系中表达CHO细胞为中国仓鼠卵巢细胞，属于哺乳动物细胞，其中表达的蛋白具有正确的折叠和糖基化修饰，同时也避免了内毒素污染。

但是，使用CHO细胞体系表达重组抗体，首先需要建立稳定细胞系。稳定细胞系可在长期连续传代过程中，稳定地表达重组蛋白，在传代60-80次之后，重组蛋白的表达水平不低于原代表达水平的70％。为鉴定建立的细胞系稳定性，传统的方法是将细胞系进行60-80次连续传代，并在传代过程进行不同代次细胞的产量评估，然后将不同代次细胞的产量与原代细胞的产量进行比较。CHO细胞的传代一般2-3天为一代，经过60次传代则需要至少120天。可以看到，传统的细胞系稳定性鉴定方法非常耗时耗力，导致做稳定性鉴定的细胞系不会太多，并且在传代过程中极易因人为因素造成结果的偏差。

因此，发明设计一种能够快速鉴定CHO细胞系早期稳定性的方法成为必要。

发明内容

本发明的目的是针对目前传统的细胞稳定性评价时间长，导致做稳定性鉴定的细胞系不会太多，并且在传代过程中极易因人为因素造成结果的偏差的不足，提供一种表达重组抗体CHO细胞系稳定性的早期鉴定方法，从而能在早期(15代以前)判定CHO细胞系的稳定性，无需再进行产量评估，可以节省较多的时间、人力和实验试剂耗材的消耗。此外，该方法还具有高通量的特点，可以同时对几十甚至上百个克隆进行鉴定，确定表达量和稳定性的高低。

除非特别指明，本文中的“早期”是指“细胞系从原始细胞库复苏后，每三天传代一次，每次以一比六传代，连续传代不超过15代的时间段”。

除非特别指明，本文的一些术语和缩略语的含义如下：

CHO：中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary)

FCM：流式细胞术(Flow Cytometry)

FITC：异硫氰酸荧光素(Fluorescein Isothiocyanate)

APC：别藻青蛋白(Allophycocyanin)

PE：藻红蛋白(P-phycoerythrin)

MFI：平均荧光强度(Median Fluorescence Intensity)

VCD：活细胞密度(Viable Cell Density)

ROS：活性氧簇(Reactive Oxygen Species)

RA：全反式维甲酸(Retinoic Acid)