[发明专利]一种猪乙型脑炎重组腺病毒、穿梭载体、质粒及疫苗

说明书

技术领域

本发明属于疫苗技术领域，尤其涉及一种猪乙型脑炎重组腺病毒、穿梭载体、质粒及疫苗。

背景技术

腺病毒载体在哺乳动物基因转移方面极具潜力，从而在基因工程疫苗上得到了广泛应用。腺病毒载体优点包括：①病毒宿主范围广，在大多哺乳动物组织和细胞中均可用来表达重组蛋白，对人和动物致病性低安全性高；②病毒可以在增殖和非增殖细胞中感染或表达基因；③腺病毒的增殖非常高效，滴度非常高；④不需要辅助病毒的协助，可以为7.5kb外源DNA为提供克隆空间；⑤腺病毒不会整合到染色体中，不会出现突变性，不会影响其它的宿主基因；⑥腺病毒能够在悬浮培养液中扩增，这就使得病毒可以大量扩增；⑦腺病毒载体能够同时表达多个基因。因为重组腺病毒具有宿主范围广，感染细胞种类多，可以表达人源和非人源蛋白，而且不会插入宿主染色体，回复突变率低，可以复制到很高的滴度等特点。

猪乙脑的主要防制方式是接种乙脑弱毒苗和灭活苗，但乙脑灭活苗的免疫原性较差，而且注射量大需重复注射，而弱毒苗容易受母源抗体的影响，并存在胎内感染的风险。为此，利用分子生物学技术来研究乙脑的基因工程疫苗，可以克服现有疫苗的缺点，而腺病毒作为研究疫苗活载体具有诸多优点。乙脑E蛋白是乙脑主要的抗原蛋白，能够刺激机体产生中和抗体，猪的白细胞介素6基因能够起到免疫增强的作用。

目前还没有构建成猪乙型脑炎病毒E基因和猪白细胞介素6基因同时插入腺病毒构建重组腺病毒作为疫苗研究的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种猪乙型脑炎重组腺病毒、穿梭载体、质粒及疫苗，旨在把乙脑E基因和猪IL6基因同时重组进入腺病毒载体，包装出具有活性的重组腺病毒，为乙脑活病毒载体疫苗的研制和乙脑基因工程疫苗的研究奠定基础。

本发明是这样实现的，一种猪乙型脑炎重组腺病毒穿梭载体，将乙脑病毒E基因、IRES基因和IL6基因顺次插入穿梭载体，得到含有目的基因的腺病毒穿梭载体。

优选地，所述穿梭载体为pAdtrack-CMV，所述腺病毒穿梭载体为pAdtrack-CMV-E-IRES-IL6。

本发明进一步提供了一种猪乙型脑炎重组腺病毒质粒，将上述腺病毒穿梭载体与腺病毒骨架载体在转化入大肠杆菌后发生同源重组，把外源基因E-IRES-IL6转入腺病毒骨架载体上，经筛选后得到含有外源基因E-IRES-IL6的重组腺病毒质粒。

优选地，所述腺病毒骨架载体为pAdEasy-1。

优选地，所述大肠杆菌为BJ5183。

本发明进一步提供了一种猪乙型脑炎重组腺病毒，是将上述重组腺病毒质粒转染宿主细胞后得到的重组腺病毒rAd-E-IRES-IL6。

优选地，所述宿主细胞为HEK293细胞。

优选地，所述转染采用阳离子脂质体法转染。

本发明进一步提供了一种猪乙型脑炎重组腺病毒疫苗，是将上述猪乙型脑炎重组腺病毒rAd-E-IRES-IL6接种宿主细胞中连续传代，且在宿主细胞内重组腺病毒E蛋白和IL6蛋白的转录和表达稳定后得到。

优选地，所述宿主细胞为HEK293。

本发明克服现有技术的不足，提供一种猪乙型脑炎重组腺病毒、穿梭载体、质粒及疫苗，采用RT-PCR技术扩增乙脑病毒(JEV)E基因、内部核糖体进入位点(IRES)基因和猪白细胞介素(IL)6基因，并将三个基因顺次克隆入腺病毒载体系统的穿梭载体pAdtrack-CMV中，与腺病毒载体系统骨架载体pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183菌株获得重组腺病毒质粒，重组腺病毒质粒转染HEK293细胞获得了重组腺病毒。采用RT-PCR和免疫印迹技术证明了JEVE蛋白和IL6蛋白在重组腺病毒rAd-E-IRES-IL6中的稳定表达；将重组腺病毒免疫动物后，能将目的基因有效转移到机体中并获得表达，且能有效的刺激机体的免疫保护反应。因此，本发明重组腺病毒疫苗安全、有效，能够刺激机体全方位的免疫应答，从而具有广泛的开发和应用前景。

附图说明

图1是本发明实施例1中乙脑病毒E基因、IRES基因和IL6基因的扩增结果；其中，泳道1～3为乙脑病毒E基因(1500bp)，泳道4～6为IRES基因(600bp)，泳道7～8为IL6基因(586bp)；

图2是本发明实施例2中乙脑病毒E基因、IRES基因和IL6基因插入穿梭载体后PCR鉴定结果图；其中，M：DNA MarkerⅢ；1：IL6基因PCR产物；2：IRES基因PCR产物；3：E基因PCR产物；