[发明专利]一种制备花青素苷标准品的方法

权利要求书

1.一种制备花青素苷标准品的方法，其特征在于，制备花青素苷标准品的方法按照以下步骤进行：

1)红花山茶的花瓣采集

在山茶花的开花期间，采集红色、颜色鲜艳的花朵，剔除雌雄蕊和花瓣以外的杂质，待提取花青素苷用，在花瓣采集精选的过程中，尽量防止花瓣受到损伤、褐化；

2)制备花青素苷原液

①将采集到的花瓣放入带盖的玻璃或塑料容器中，稍微用手压实后，再继续加入花瓣，加到容器口下方2-3cm处；

②用纯度为98％以上的醋酸和乙醇，以1:1的比例混合均匀获得50％醋酸乙醇溶液；向盛有花瓣的容器中加入50％醋酸乙醇溶液，加入到容器高度的四分之三位置处；溶液加好后用竹棒搅动花瓣，使花瓣充分浸泡在溶液中，将盖子盖好后在室温下浸泡12-24h，滤出提取液；

③再在容器中加入50％醋酸乙醇溶液，按步骤②的方法对容器内的山茶花的花瓣再进行浸提2次,并收集每次的滤液；

④将3次浸提收集的滤液充分混合，在40℃下减压浓缩，蒸发提取液中的水、乙醇和醋酸，在蒸馏瓶中残留的物质即为花青素苷原液，作为柱层析分离花青素苷单体使用；

3)花青素苷的分离和纯化

根据所提取标准物质的需要，选择不同的山茶花野生种或园艺品种为提取原料，对不同花青素苷类型进行分离和纯化。

2.根据权利要求1所述的一种制备花青素苷标准品的方法，其特征在于，所采用的山茶花的提取原料为滇山茶、怒江山茶、山茶和茶梅及其园艺品种中的任一种。

3.根据权利要求2所述的一种制备花青素苷标准品的方法，其特征在于，所采用的山茶花种类为滇山茶、山茶、或茶梅的野生种或园艺品种中的任一种，在第3)步中花青素苷的分离和纯化的过程中，其对应的Cy3G型或Dp3G型或Cy3GX型花青素苷的提取步骤如下：

①配制流动相

流动相以A液和B液按比例配制成线性关系的混合溶液：A液为5％醋酸水溶液(5mL食用醋酸溶解于95mL纯净水中)，B液为5％醋酸乙醇溶液(5mL食用醋酸溶解于95mL食用酒精中)；

②进行柱层析

以MCI gel CHP-20P(三菱化学)为填料，酸性A、B液为流动相，采用反相开口柱层析法，将花青素苷原液进行分离，获得5-6组份花青素苷粗精制馏分物；

将此粗制馏分物经Sephadex LH-20(GE Healthcare Biosciences AB)反相柱层析分离纯化，可获得5-6组分花青素苷含量达80％左右的粗精制馏分物；

将上述粗精制馏分物经Chromatorex ODS(Fuji Silysia Chemical LTD)反相柱层析纯化，可获得纯度为90％以上的各种花青素苷精制产品；

最后再用Sephadex和ODS为填料的层析柱经过反复层析纯化，即可获得纯度为98％以上的Cy3G型或Dp3G型或Cy3GX型的各种花青素苷标准物质；

在柱层析中，流动相的母液A、B液以100：0比例混合的缓冲溶液作为起始浓度；根据层析柱的大小，加入300-500mL的混合缓冲溶液，然后等梯度逐步增加流动相中B液的比例达到100％进行洗脱，直到花青素苷全部得到洗脱为止。

4.根据权利要求2所述的一种制备花青素苷标准品的方法，其特征在于，所采用的山茶花种类为怒江山茶野生种或园艺品种，在第3)步中花青素苷的分离和纯化的过程中，其对应的Cy3G5G型花青素苷的提取步骤如下：

①配制流动相

流动相以A液和B液按比例配制成线性关系的混合溶液：A液为5％醋酸水溶液(5mL食用醋酸解于95mL纯净水中)，B液为5％醋酸乙醇溶液(5mL食用醋酸溶解于95mL食用酒精中)；

②进行柱层析

先后以MCI和Sephadex为填料，酸性A、B液为流动相，采用反相开口柱层析法，将花青素苷原液进行分离，可获得5-6组份花青素苷粗精制馏分物；

再将此粗精制物经ODS反相柱层析分离，可获得纯度为90％以上的各种花青素苷精制产物；

最后再用Sephadex和ODS为填料的层析柱把上述花青素苷精制产物反复层析纯化，即可获得纯度为98％以上的Cy3G5G型各种花青素苷标准物质。