[发明专利]可删除筛选标记基因的植物表达载体及其用途

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及可删除筛选标记基因的植物表达载体及其用途。

背景技术

目前柑橘遗传转化通常用的载体一般含有筛选标记基因，如报告基因gus，抗Kan，抗除草剂Bar等筛选标记基因，这些基因对生物安全性构成严重威胁。其存在的不足是：再生率低，再生时间长，不定芽成活率低，加有报告基因，进入田间抗性分析时间长等。如Kan作为柑橘遗传转化中常用的筛选标记基因，但由于再生芽上残存的农杆菌与邻近的阳性转化细胞提供的抗性。Kan并不能完全抑制非阳性芽的生长，尤其是多年生木本植物Kan筛选率更低，如通过根癌农杆菌介导Cry1Ac基因转化‘雪青’梨，从转化抗性再生芽中仅获得约10％的PCR阳性芽；双如冰糖橙转化后获得Kan抗性芽有105个，经GUS染色，阳性芽为24个，进一步PCR检测仅得到15株阳性芽，约14％PCR阳性芽；纽荷尔脐橙外植体转化后获得Kan抗性芽13个，PCR检测抗性芽仅2株为阳性；红江橙转化后获得12株Kan抗性芽，经GUS染色，阳性芽仅2株；且最终都要通过对大量转化再生芽进行PCR检测，才能初步获得转基因阳性植株。

目前，即无Kan筛选基因，也无报告基因如GUS等新型转基因载体以获得无选择标记基因转基因材料成为基因工程育种的趋势，因此，利用这类植物表达载体进行柑橘遗传转化，如在Cre/Loxp系统删除作用下不仅获得目的功能基因的转基因植株，还避开抗生素、抗除草剂等标记基因对生物学安全性影响的风险，为转基因血橙将来进行安全性评价提供分子证据，使之快速进入生产应用提供有利保障。

目前，通过转座途径、染色体内同源重组、目标基因与标记基因共转化、位点专一性重组等措施来剔除标记基因，最通用最广泛的是位点专一重组途径，首先构建含有位点专一重组系统Cre/LoxP的标记基因删除植物表达载体，通过根癌农杆菌介导法将删除系统整合到柑橘基因组中，随后诱导表达控制重组系统Cre基因表达来删除筛选标记基因，最终获得只含外源目的功能基因的无标记转基因柑橘再生芽。

现有的删除转基因柑橘中筛选标记基因的操作如下：

首先采用1个结合化学诱导系统XVE和位点专一性重组系统Cre/LoxP的标记基因删除载体，通过农杆菌介导法对柑橘上胚轴茎段进行无选择标记遗传转化，对侵染后茎段接种在MS+3mg/L6-BA培养基上，共培养3天后转移到筛选培养基(MS+75mg/L卡那霉素+500mg/L头孢霉素)中，筛选培养21天后可观察到抗性芽萌发，切下带1～2mm外植体的抗性芽，转移至含有雌二醇的化学诱导培养基(MS+3mg/L6-BA+500mg/L头孢霉素+2μmol/L雌二醇)上诱导，15d后用荧光显微镜观察，成功观测到绿色荧光.继续诱导培养30天后，进行试管嫁接，30天后，提取接穗基因组DNA进行PCR扩增，检测到DNA的切除现象，获得无选择标记转基因植株。目前对这种再生芽继续培养成植株的方法通常是采用茎尖试管嫁接获得再生植株，详细步骤如下：以14天试管无菌实生苗为嫁接砧木，嫁接时，将无菌砧木苗切去下胚轴端部保留约4～6cm长，切去上胚轴顶部留约2～4cm长，顶端劈口。切取再生生长了45天长约0.3～0.5cm的再生芽，基部斜切，插入砧木的劈口处，对齐形成层。置于包含滤纸桥的液体嫁接培养基中培养，30天后嫁接苗伸长约2cm时，称取100mg叶片(大约一片叶)常规法微量提取DNA，进行PCR检测后才能嫁接至温室中进行后期转基因安全性评价。

采用上述方法存在以下缺陷：

缺陷1：再生培养基中需要添加75mg/L kan，诱导培养中需要添加2μmol/L雌二醇，这些外源化学物质的添加影响了再生芽的萌发及生长，从上胚轴茎段农杆菌侵染后，需要21天才能萌芽，这些芽转入添加2μmol/L雌二醇的诱导培养基中，诱导培养45天后，总共要花66天后再生芽才能进行试管嫁接，从而延缓转基因再生苗的获得。

缺陷2：再生芽嫁接成苗生长过程中需多次对砧木抹芽，工作量大，且容易污染时，从而延缓转基因再生苗的获得。而且茎尖嫁接操作复杂：嫁接3天后，从砧木切口处会长出很多再生芽，与接穗芽愈合生长产生竞争，如果不及时抹去从砧木上长出的再生芽，接穗芽一般竞争不过从砧木上长出的再生芽，几天后接穗芽就会萎黄枯死，而且，抹过一次的砧木再生芽还会继续萌发二，三，四次至多次再生芽，需要反复抹3～4次砧木芽，直至接穗芽长出3～4片叶(约2cm)可用于PCR检测，当面对几百上千个转化再生芽时需要进行茎尖嫁接，其工作量大，操作复杂，且容易污染。

发明内容