[发明专利]一种弱化发酵过程中乙酸积累以增强L‑色氨酸产量的基因工程菌及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种弱化发酵过程中乙酸积累以增强L-色氨酸产量的基因工程菌及其构建方法，特别是利用蛋白质工程的定点突变方法来降低比活力的技术及利用Red重组技术，通过两步无痕替换法在基因组上进行基因置换的技术，属于代谢工程和基因工程领域。

背景技术

L-色氨酸(L-tryptophan,L-Trp)作为人体内的一种必需氨基酸，广泛应用于医药、食品、饲料等行业。近年来，国外通过代谢工程的手段，逐渐培育出一批高产的L-Trp生产菌株，但其在发酵过程中仍存在发酵后期L-Trp生产速率下降明显，副产物积累等问题，尤其是副产物乙酸的积累。当乙酸浓度超过2g/L时就会影响菌株的生长及L-Trp的合成，为尽可能的减少发酵过程中乙酸的积累以保证菌体的正常生长，发酵过程中必须保证溶氧充足，然而这在工业化生产中不仅增加成本而且也很难达到实验室提供的溶氧条件。因此减少发酵过程中乙酸的积累及降低菌体对溶氧的需求，对提高L-Trp的工业化生产具有重要意义。

大肠杆菌通过两条途径生成乙酸：⑴丙酮酸氧化酶途径，丙酮酸在PoxB作用下生成乙酸；⑵乙酰磷酸途径,acetyl-CoA在Pta(磷酸乙酰基转移酶)作用下生成acetyl-p,然后AckA(乙酸激酶)催化acetyl-p生成乙酸，而后者是生成乙酸的主要途径。磷酸乙酰基转移酶是微生物体内乙酸代谢途径AckA-pta中的一个关键酶，也是在工业微生物发酵过程中产生副产物乙酸的关键酶之一。因此获得比活力降低的磷酸乙酰基转移酶突变体，并对基因组上的原编码基因进行替换，编码比活力降低的磷酸乙酰基转移酶，有助于减少发酵过程中乙酸的积累，从而有利于实现菌株的高密度发酵，而且有利于增加L-色氨酸的生成。本发明以L-色氨酸生产菌株(重组大肠杆菌)FB-04(记作TS)(J Ind Microbiol Biotechnol,2011,38:1921–1929)为出发菌株，在其基因组上将磷酸乙酰基转移酶编码基因内的一个碱基进行替换，导致其编码的第69位脯氨酸替换成亮氨酸，降低了磷酸乙酰基转移酶的比活力，发酵过程中副产物乙酸的积累减少，L-色氨酸产量增加，为工业化发酵生产其他氨基酸提供借鉴。

发明内容

本发明提供了一种弱化发酵过程中乙酸积累以增强L-色氨酸产量的基因工程菌，其特征在于，在L-色氨酸生产菌株(重组大肠杆菌)FB-04(记作TS)(J Ind Microbiol Biotechnol,2011,38:1921–1929)基因组上将磷酸乙酰基转移酶编码基因内的一个碱基进行替换，导致其编码的第69位脯氨酸替换成亮氨酸，降低了磷酸乙酰基转移酶的比活力，发酵过程中副产物乙酸的积累减少，L-色氨酸产量增加。

所述磷酸乙酰基转移酶突变体以大肠杆菌TS磷酸乙酰基转移酶氨基酸序列(与NCBI登录号:NP_416800.1所示氨基酸序列相同)为出发序列，将第69位脯氨酸替换成亮氨酸得到的突变体。

能表达权利要求1所述磷酸乙酰基转移酶突变体的基因工程菌或转基因细胞系，及在基因组上进行无痕替换的载体也属于本专利要求保护的范围。

本发明不仅提供一种制备所述磷酸乙酰基转移酶突变体的方法，还提供一种制备所述突变菌株的方法。利用Red重组方法，通过两步无痕法在基因组上进行基因置换。

具体而言，是以大肠杆菌TS磷酸乙酰基转移酶核苷酸序列为出发序列，将其内部一个碱基进行替换，使第69位脯氨酸替换成亮氨酸，并在TS基因组上进行磷酸乙酰基转移酶编码基因的置换，使其编码的氨基酸第69位脯氨酸替换成亮氨酸得到的突变菌株。

所述制备一种弱化发酵过程中乙酸积累以增强L-色氨酸产量的基因工程菌的方法，具体步骤如下：

1)利用Swiss-model软件对源自大肠杆菌磷酸乙酰基转移酶进行模拟，获得磷酸乙酰基转移酶空间结构，通过对磷酸乙酰基转移酶的序列以及空间结构进行分析，确定要突变的氨基酸位点。

2)根据大肠杆菌磷酸乙酰基转移酶氨基酸序列(NCBI登录号:NP_416800.1)，将其所对应的编码核苷酸序列(Genbank登陆号NC_000913.3：2414747-2416891)克隆到质粒pET-24a(+)中，构建重组质粒。

3)设计突变引物，对磷酸乙酰基转移酶基因序列进行定点突变，将所述位点的氨基酸进行替换，获得含有突变磷酸乙酰基转移酶序列的重组载体。