[发明专利]一种弱化发酵过程中乙酸积累以增强L‑色氨酸产量的基因工程菌及其构建方法

权利要求书

1.一种弱化发酵过程中乙酸积累以增强 L- 色氨酸产量的基因工程菌，其特征在于，在 L- 色氨酸生产菌株大肠杆菌TS 基因组上将磷酸乙酰基转移酶编码基因内的一个碱基进行替换，导致其编码的第 69 位脯氨酸替换成亮氨酸，降低了磷酸乙酰基转移酶的比活力，发酵过程中副产物乙酸的积累减少，L- 色氨酸产量增加。

2.一种磷酸乙酰基转移酶突变体，其特征在于，是以大肠杆菌 TS 磷酸乙酰基转移酶氨基酸序列为出发序列，将第 69 位脯氨酸替换成亮氨酸得到的突变体，所述大肠杆菌 TS 磷酸乙酰基转移酶的氨基酸序列为NCBI 登录号 :NP_416800.1 所示的氨基酸序列。

3.权利要求 1 所述基因工程菌的构建方法，其特征在于，在基因组上进行磷酸乙酰基转移酶编码基因的置换，使其编码的氨基酸第 69 位脯氨酸替换成亮氨酸得到突变菌株。

4.根据权利要求 3 所述的构建方法，其特征在于，具体步骤如下： 1) 利用 Swiss-model 软件对源自大肠杆菌TS的磷酸乙酰基转移酶进行模拟，获得磷酸乙酰基转移酶空间结构，通过对磷酸乙酰基转移酶的序列以及空间结构进行分析，确定要突变的氨基酸位点；

2) 根据大肠杆菌TS磷酸乙酰基转移酶氨基酸序列，将其所对应的编码核苷酸序列克隆到质粒 pET-24a(+) 中，构建重组质粒；

3) 设计突变引物，对磷酸乙酰基转移酶基因序列进行定点突变，将所述位点的氨基酸进行替换，获得含有突变磷酸乙酰基转移酶序列的重组载体；

4)设计重叠PCR引物，分别以pKD13质粒和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp. subtilis str.168) 基因组为模版，通过重叠 PCR 的方法得到卡那霉素和 SacB 基因相连的 DNA 片段，将此片段克隆到 pMD18 载体中，构建用于无痕替换的质粒 kan-sacB/pMD18；

5) 设计含磷酸乙酰基转移酶基因同源臂的重组引物，以 kan-sacB/pMD18 质粒为模版，采用 PCR 方法得到两端含同源臂的 kan-sacB DNA 片段，将此片段转入到 TS 菌中，利用 Red 重组获得基因组上磷酸乙酰基转移酶基因被 kan-sacB DNA 片段替换的突变菌株；

6) 以 3) 所述突变的重组载体为模板，将用 PCR 方法得到的突变的磷酸乙酰基转移酶基因转入到 5) 所述的菌株中，利用 Red 重组获得基因组上磷酸乙酰基转移酶突变的突变菌株。

5.能表达生产权利要求 2 所述磷酸乙酰基转移酶突变体的在基因组上进行无痕替换的质粒。

6.权利要求 1 所述弱化发酵过程中乙酸积累以增强 L- 色氨酸产量的基因工程菌在发酵生产其他氨基酸及蛋白质领域的应用。