[发明专利]一种快速筛选产龙胆苦苷重组酵母菌株的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于PCR扩增技术快速筛选产龙胆苦苷重组酵母菌株的方法。

背景技术

龙胆苦苷(Gentiopicroside)为裂环环烯醚萜苷类化合物，大量存在于药用植物秦艽(Gentianamacrophylla，G.macrophylla)中，是评价龙胆属药材的主要指标，具有抗氧化、抗炎、保肝、利胆及抗肿瘤等作用。但随着临床用药量的增加、野生资源过渡采挖，造成了秦艽资源的严重匮乏。因此，迫切需要寻求及扩大龙胆苦苷新型药源途径来满足其日益增长的需求。

近年来，寻找和扩大龙胆苦苷药源是一个十分活跃的研究领域，也取得了一定进展，主要包括以下两个方面：(1)秦艽的人工栽培；(2)利用生物技术提高秦艽中的龙胆苦苷，包括秦艽组织培养、悬浮细胞培养和毛状根的培养。但是，人工栽培存在周期长、成活率低、农药残留超标和有效成份较低等弊端；利用组织培养和悬浮细胞培养秦艽细胞生产龙胆苦苷均存在龙胆苦苷产量不稳定现象，同时在毛状根培养体系中的有效成分产量提高并不显著。因此，随着秦艽野生药用植物资源日趋减少，以及利用传统植物培养技术生产龙胆苦苷存在的各种问题，促使利用现代基因工程技术探索获得新型药源途径以期解决龙胆苦苷来源问题已成为一个潜力巨大的新型策略。

低能离子注入技术是在20世纪80年代由中科院合肥物质科学研究院等离子体所和安徽省农科院科研人员创立并发展起来的新兴交叉学科离子束生物工程学，近几年，离子束生物工程技术被广泛应用于植物和微生物的品质改良及种质创新，并取得了丰硕成果。毛培宏等分别通过Ar⁺和N⁺注入介导蓝麻黄基因组DNA在汉逊酵母中的随机转化，获得了遗传稳定酵母工程菌，其培养液中麻黄碱和伪麻黄碱的最高产量分别为18.85mg/L和4.11mg/L。而利用离子注入介导甘草基因组DNA转化汉逊酵母，获得了遗传稳定的酵母工程菌，其甘草酸的最高产量达到114.49mg/L。低能离子注入技术虽然在重组工程菌的构建上有一定的方向性和目的性，但其也有较大的随机性，即注入后候选重组菌株数量比较大，所以建立一种高通量的快速筛选方法尤为重要。目前，基于低能离子注入介导的合成生物学方法构建重组菌株生产天然产物，其所采用的筛选方法一般是依据产物的化学性质设计特征性化学反应进行分析筛选，如毛培宏等利用低能离子注入方法介导麻黄基因组转化酵母，其所运用的筛选方法为根据目的产物麻黄碱的特征性颜色反应进行筛选，结果研究人员从3000多株重组菌株筛选获得9株产麻黄碱酵母重组菌株，但该筛选方法存在工作量大，筛选效率低，加上颜色反应需要一定产量的目的产物，这严重制约了低能离子注入介导的合成生物学的广泛运用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速筛选产龙胆苦苷重组酵母菌株的方法。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

1)重组菌株初筛：将经过低能离子注入介导秦艽总基因组DNA转化处理后的出发酵母菌株接种至YPD固体培养基上进行培养得到大量转化子(即生长在YPD固体培养基上的单菌落)，提取转化子基因组DNA，以转化子基因组DNA为模板，针对MECT基因、MECPS基因以及GGPPS基因的特异性片段分别进行三轮PCR扩增，并分别对扩增产物进行核酸电泳分析，根据电泳分析结果从转化子中筛选得到同时含有MECT基因片段、MECPS基因片段以及GGPPS基因片段的重组酵母菌株；

2)重组菌株复筛：将步骤1)筛选得到的重组酵母菌株于YPD液体培养基中进行发酵培养，通过对发酵培养所得发酵液进行HPLC分析筛选得到产龙胆苦苷重组酵母菌株。

采用上游引物F1和下游引物R1对所述MECT基因的特异性片段进行PCR扩增，上游引物F1的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，下游引物R1的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

采用上游引物F2和下游引物R2对所述MECPS基因的特异性片段进行PCR扩增，上游引物F2的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示，下游引物R2的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示。

采用上游引物F3和下游引物R3对所述GGPPS基因的特异性片段进行PCR扩增，上游引物F3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示，下游引物R3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示。

本发明的有益效果体现在：