[发明专利]一种晶状体上皮干细胞的分离培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种晶状体上皮干细胞的分离培养方法。

背景技术

干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞。根据干细胞的发育潜能分为三类：全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞。干细胞(Stem Cell)是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。

晶状体是一个双凸透镜状的透明组织，由悬韧带悬挂在虹膜后方、玻璃体正前方，是眼内重要的屈光间质。人类晶状体前表面的曲率半径约10mm，后表面的曲率半径约6mm。晶状体表面包裹了一层无细胞的透明弹性薄膜，分布在晶状体前表面的叫做前囊膜，由位于其下的晶状体上皮细胞分泌的胶原纤维形成，晶状体上皮附着在前囊膜上。晶状体上皮细胞呈单层柱状，附着在晶状体前囊膜上，其可分为中央区(central region)和两侧对称的赤道区(equatorial region)。中央区上皮细胞(central anterior epithelium)单层排列在前囊膜下，代谢缓慢；赤道区上皮细胞(equatorial epithelial)分裂活跃，通过分裂产生子细胞逐步向晶状体内部移动并分化成为晶状体纤维。晶状体赤道部上皮细胞在整个生命活动中分裂活跃，其不断分裂产生子细胞的现象和干细胞的自我更新特性类似。

王潆，“小鼠晶状体干细胞的初步研究”，第四军医大学2013年硕士论文，利用干细胞的特性，通过BrdU标记滞留细胞实验，检测到晶状体上皮中存在表达干细胞标志物SOX2的细胞，确定晶状体上皮中存在干细胞。但是未分离得到晶状体上皮干细胞。

发明内容

本发明公开了一种晶状体上皮干细胞的分离培养方法，其特征在于，它包括以下步骤：

(1)取晶状体前囊膜及附着的上皮，剪成碎片，消化，将获得的细胞铺于包被有基质的培养瓶、培养板或培养皿中；

(2)加入添加有15～25％FBS、50～150μg/L FGF、5-10mg/L胰岛素、5-10mg/L氢化可的松、5-10mg/L霍乱弧菌毒素、0.01-0.05mg/L3,3′,5-碘-L-对羟基苯丙氨酸、1-5mg/L腺嘌呤、5～10mg/L甘氨酸、6～12mg/L丙氨酸、10～16mg/L天冬酰胺、10～16mg/L天冬氨酸、12～18mg/L谷氨酸、8～15mg/L脯氨酸、7～14mg/L丝氨酸的MEM培养液，放入37℃孵箱中培养，2-3天形成克隆，10-14天可形成单层活性的晶体干细胞细胞。

所述消化的方法是：将碎片加0.2％的胶原酶IV溶液中，消化2h，去除胶原酶，加入0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液，混匀，过滤，即得细胞。

其中，步骤(1)中，所述基质为基质胶、明胶、胶原、多聚赖氨酸和/或层粘连蛋白中的一种或两种以上的组合。

进一步地，培养瓶、培养板或培养皿包被基质胶的方法为：加入含1％～3％基质胶的DMEM/F12培养液或无菌PBS溶液，完全覆盖底部即可，在37℃孵箱中孵育0.5～2小时，孵育完后吸弃培养液，用无菌PBS清洗3～5次。

更进一步地，基质胶的浓度为2％；孵育时间为1小时。

其中，步骤(2)中，FBS浓度为20％，FGF浓度为100μg/L，胰岛素浓度为10mg/L，氢化可的松浓度为10mg/L，霍乱弧菌毒素浓度为10mg/L，3,3′,5-碘-L-对羟基苯丙氨酸浓度为0.01mg/L，腺嘌呤浓度为5mg/L，甘氨酸浓度为7.5mg/L、丙氨酸浓度为8.9mg/L、天冬酰胺浓度为13.2mg/L、天冬氨酸浓度为13.3mg/L、谷氨酸浓度为14.7mg/L、脯氨酸浓度为11.5mg/L、丝氨酸浓度为10.5mg/L。

其中，步骤(2)中，培养液中还含有抗生素。

进一步地，所述的抗生素为50～100U/mL的青霉素和50～100μg/mL的链霉素。

本发明还提供了晶状体上皮干细胞的分离培养液，它是添加有15～25％FBS、50～150μg/L FGF、5-10mg/L胰岛素、5-10mg/L氢化可的松、5-10mg/L霍乱弧菌毒素、0.01-0.05mg/L3,3′,5-碘-L-对羟基苯丙氨酸、1-5mg/L腺嘌呤、5～10mg/L甘氨酸、6～12mg/L丙氨酸、10～16mg/L天冬酰胺、10～16mg/L天冬氨酸、12～18mg/L谷氨酸、8～15mg/L脯氨酸、7～14mg/L丝氨酸的MEM培养液。