[发明专利]一种晶状体上皮干细胞的分离培养方法

权利要求书

1.一种晶状体上皮干细胞的分离培养方法，其特征在于：它包括以下步骤：

(1)取晶状体前囊膜及附着的上皮，剪成碎片，消化，将获得的细胞铺于包被有基质的培养瓶、培养板或培养皿中；

(2)加入添加有15～25％FBS、50～150μg/L FGF、5-10mg/L胰岛素、5-10mg/L氢化可的松、5-10mg/L霍乱弧菌毒素、0.01-0.05mg/L3,3′,5-碘-L-对羟基苯丙氨酸、1-5mg/L腺嘌呤、5～10mg/L甘氨酸、6～12mg/L丙氨酸、10～16mg/L天冬酰胺、10～16mg/L天冬氨酸、12～18mg/L谷氨酸、8～15mg/L脯氨酸、7～14mg/L丝氨酸、50～100U/mL青霉素、50～100μg/mL链霉素的MEM培养液，放入37℃孵箱中培养，得有活性的细胞，即得晶状体上皮干细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述消化的方法是：将碎片加0.2％的胶原酶IV溶液中，消化2h，去除胶原酶，加入0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液，混匀，过滤，即得细胞。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述基质为基质胶、明胶、胶原、多聚赖氨酸和/或层粘连蛋白中的一种或两种以上的组合。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：培养瓶、培养板或培养皿包被基质胶的方法为：加入含1％～3％基质胶的DMEM/F12培养液或无菌PBS溶液，完全覆盖底部即可，在37℃孵箱中孵育0.5～2小时，孵育完后吸弃培养液，用无菌PBS清洗3～5次。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述基质胶的浓度为2％；孵育的时间为1小时。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，FBS浓度为20％，FGF浓度为100μg/L，胰岛素浓度为10mg/L，氢化可的松浓度为10mg/L，霍乱弧菌毒素浓度为10mg/L，3,3′,5-碘-L-对羟基苯丙氨酸浓度为0.01mg/L，腺嘌呤浓度为5mg/L，甘氨酸浓度为7.5mg/L、丙氨酸浓度为8.9mg/L、天冬酰胺浓度为13.2mg/L、天冬氨酸浓度为13.3mg/L、谷氨酸浓度为14.7mg/L、脯氨酸浓度为11.5mg/L、丝氨酸浓度为10.5mg/L。

7.一种晶状体上皮干细胞的分离培养液，其特征在于：它是添加有15～25％FBS、50～150μg/L FGF、5-10mg/L胰岛素、5-10mg/L氢化可的松、5-10mg/L霍乱弧菌毒素、0.01-0.05mg/L3,3′,5-碘-L-对羟基苯丙氨酸、1-5mg/L腺嘌呤、5～10mg/L甘氨酸、6～12mg/L丙氨酸、10～16mg/L天冬酰胺、10～16mg/L天冬氨酸、12～18mg/L谷氨酸、8～15mg/L脯氨酸、7～14mg/L丝氨酸的MEM培养液。

8.根据权利要求7所述的培养液，其特征在于：FBS浓度为20％，FGF浓度为100μg/L，胰岛素浓度为10mg/L，氢化可的松浓度为10mg/L，霍乱弧菌毒素浓度为10mg/L，3,3′,5-碘-L-对羟基苯丙氨酸浓度为0.01mg/L，腺嘌呤浓度为5mg/L，甘氨酸浓度为7.5mg/L、丙氨酸浓度为8.9mg/L、天冬酰胺浓度为13.2mg/L、天冬氨酸浓度为13.3mg/L、谷氨酸浓度为14.7mg/L、脯氨酸浓度为11.5mg/L、丝氨酸浓度为10.5mg/L。

9.根据权利要求7所述的培养液，其特征在于：所述培养液中还含有抗生素；所述的抗生素为50～100U/mL的青霉素和50～100μg/mL的链霉素。