[发明专利]一种检测平头炭疽菌的环介导等温扩增引物组合物及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物检测领域，涉及一种检测平头炭疽菌的环介导等温扩增引物组合物及其应用。

背景技术

大豆炭疽病是世界各大豆产区的重要病害，普遍发生于我国东北、华北、华东、西北、华南等重要大豆产区，据报导，黑龙江、吉林、辽宁等16个省均有发生^[1]。大豆炭疽病从苗期至收获期均可发生，子叶、子茎、叶片、叶柄、茎杆、荚果及种子皆可受害。病菌在子叶上病斑呈圆形，红褐色至黑褐色、凹陷。茎上病斑为褐色或红锈色，细条形，凹陷和龟裂。成株期叶片上病斑主要发生于叶脉，呈多角形，红褐色至黑褐色。茎上病斑与苗期相似。荚上病斑呈椭圆形或近圆形，边缘常隆起，中央部凹陷，潮湿时各患部斑面上出现朱红色小点或小黑点^[2,3]。

近年来，随着大豆种植面积不断扩大，大豆炭疽病的发生呈扩大蔓延、加重危害的趋势，全国各大豆产区均有炭疽病的发生，对大豆生产造成很大威胁。为了阻止大豆炭疽病传播范围的不断扩大，使大豆炭疽病得到控制，需要对其进行快速、准确地检测。

大豆炭疽病可由多种炭疽菌侵染引起，迄今中国已报道引起大豆炭疽病的炭疽菌有平头炭疽菌(C.truncatum)、胶孢炭疽菌(C.gloeosporioide)、辣椒炭疽病菌(C.capsici)、黑线炭疽菌(C.dematium)和毁灭炭疽菌(C.destructivum)等^[4,5]。其中，平头炭疽菌是最为常见的病原菌之一。因此针对平头炭疽菌的分子检测我们进行了一系列的研究。

平头炭疽菌(C.truncatum)是一类重要的植物病原菌，其地理分布和寄主范围均很广泛。该菌无性态分类地位是半知菌亚门、腔孢纲、黑盘孢目、黑盘孢科、炭疽菌属，有性态则隶属于子囊菌亚门、核菌纲、球壳目、球壳科、小丛壳属。该菌在PDA培养基上，病原菌落圆形，边缘整齐，菌丝较稀疏，紧贴培养基生长，初为白色，后为浅灰色，培养过程中菌落有扇变现象，扇变部分菌丝较发达，绒毛状。分生孢子盘黑色堆状突起，单生至丛生，近圆形，大小变化很大，有时许多分生孢子盘连成一片；刚毛黑褐色，1～3个分隔，长41.76～194.12μm；分生孢子梗无色至淡褐色；分生孢子无色，新月形，无分隔，两头钝尖，大小(18.82～26.47)×(3.53～5.29)μm；附着胞(6.60～10.63(8.21))×(4.31～8.00(6.47))μm，椭圆形，偶见姜瓣形^[5]。

传统病原菌的分类、鉴定主要基于形态学特性、致病性测定等，操作繁琐，耗时长、灵敏度低、易受人为及环境等诸多因素的干扰^[6]，不能在病害潜伏期和初发期做出诊断，很难对病害发生进行及时的监测和有效控制。

随着分子生物学的发展，分子生物学技术已逐步应用到平头炭疽菌的研究中。上世纪八十年代发展起来的普通PCR的方法已经成功用于检测平头炭疽菌^[7]，但普通PCR是腐故陈旧的技术且具若干缺陷，例如检测时间仍然比较长，大概6～8h，对靶基因区段的识别位点少，检测特异性与灵敏度偏低；检测过程较繁琐等，难以满足需求。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是日本的荣研株式会发明的一种新的核酸扩增技术^[8]，因为其操作简单、快速、特异性高、成本低等优点，成为可以替代普通PCR的新的核酸扩增技术。它是针对靶基因的6个区域设计4种特异的引物，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60～65℃范围60～70min内，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物——白色的焦磷酸镁沉淀产生^[9]。由于LAMP扩增过程依赖识别靶序列6个独立区域，所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在恒温条件下进行，普通水浴锅或者有稳定热源的设备就能满足反应要求，检测成本大大降低。

靶标基因的选择是LAMP检测的重要因素之一。普通PCR常用的靶标基因有核糖体基因转录间隔区(Internal transcribed space，ITS)^[10]，然而许多学者认为该靶标不能够在种的水平上准确的区分炭疽菌属真菌。