[发明专利]一种山羊痘、羊口疮二联细胞弱毒疫苗及其制备方法和用途

权利要求书

1.一种山羊痘、羊口疮病毒二联细胞弱毒疫苗，其特征在于有效成分包括山羊痘病毒细胞传代致弱毒以及羊传染性脓疱病毒细胞传代致弱毒，其中，所述的山羊痘病毒细胞传代致弱毒为山羊痘病毒细胞传代致弱毒Goatpox Virus HN-XY2010F43株，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2015年1月14日，保藏编号为CCTCC NO：V201503，所述的羊传染性脓疱病毒细胞传代致弱毒为羊传染性脓疱病毒细胞传代致弱毒Orf Virus HB-TS09F65株，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2014年3月19日，保藏编号为CCTCC NO：V201406。

2.权利要求1所述的山羊痘、羊口疮病毒二联细胞弱毒疫苗在制备防治羊痘以及羊口疮药物中的应用。

3.一种制备权利要求1所述的山羊痘、羊口疮病毒二联细胞弱毒疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)病毒抗原的制备

选生长良好布满单层的新生牛睾丸原代细胞和新生羊睾丸原代细胞，倾去营养液，按原营养液体积的1-10％分别接种权利要求1所述的羊传染性脓疱病毒细胞传代致弱毒以及山羊痘病毒细胞传代致弱毒的病毒液，吸附5-15分钟后加DMEM维持液，调PH至7.0～7.2，加青霉素、链霉素各100单位/ml，于37℃、5％CO2浓度培养箱中进行培养；培养40～72h，细胞病变达到75％以上时收获病毒，置-20℃冰箱反复冻融两次，然后进行无菌检验、安全检验、支原体检验、外源病毒检验，达到《中华人民共和国兽医生物制品质量标准》中规定的各项指标，且病毒滴度不低于10^-3.5TCID₅₀/0.1ml时，作为山羊痘、羊传染性脓疱病毒细胞传代致弱毒抗原，备用；

(2)疫苗的配制和冻干

将步骤(1)制备的各项指标都合格的山羊痘、羊传染性脓疱病毒细胞传代致弱毒抗原以体积比1︰1混合，再与耐热冻干保护剂以体积比1︰1的比例混匀后，以2mL/瓶无菌条件下封装于链瓶内，在低温冷冻干燥机内进行冻干，即为山羊痘、羊口疮病毒二联细胞弱毒疫苗，将其在2℃-8℃下保存。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，按原营养液体积的5％分别接种权利要求1所述的羊传染性脓疱病毒细胞传代致弱毒以及山羊痘病毒细胞传代致弱毒的病毒液，吸附10分钟后加DMEM维持液，调PH至7.0～7.2，加青霉素、链霉素各100单位/ml，于37℃、5％CO₂浓度培养箱中进行培养。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述耐热冻干保护剂中含有海藻糖30～70g/L，脱脂奶粉10～30g/L，聚乙烯吡咯烷酮10～30g/L，明胶5～15g/L，精氨酸0.5～4g/L，维生素C 1～5g/L，剩余成分为超纯水。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述耐热冻干保护剂中含有海藻糖50g/L，脱脂奶20g/L，聚乙烯吡咯烷酮20g/L，明胶10g/L，精氨酸1.5g/L，维生素C 2.5g/L，剩余成分为超纯水。