[发明专利]以Gemini表面活性剂反胶束从菠萝皮中萃取分离菠萝蛋白酶的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程中反胶束萃取技术领域，也涉及菠萝皮的回收利用技术。

背景技术

菠萝蛋白酶是典型的巯基蛋白酶，广泛存在于菠萝果实、芽、叶、茎中，它在生物化工中用于干酪、明胶、水解蛋白的生产，在食品工业中作为一种食品添加剂，使肉质嫩化、啤酒澄清；在医药工业中，可以治疗水肿及多种炎症，对正常组织无害，不影响植皮，适用于中小面积深度烧伤的治疗。

目前，用于工业化生产、提取菠萝蛋白酶的方法主要有三种：高岭土吸附法、单宁沉淀法、超滤浓缩法；但这三种方法不仅生产成本高昂、易造成污染环境、生产工艺和操作复杂，而且所得酶活性也不足以满足医药级别及食品中对酶活性要求较高的应用。且相关研究多集中于从菠萝茎和果肉中提取菠萝蛋白酶。

我国虽然菠萝资源丰富，年产量在140万吨以上，而在用于加工菠萝罐头、 果 汁等食品上，采用的完全是菠萝果肉部分，剩下的菠萝皮等部分就被作为废弃物而扔掉，这样不仅造成了资源的浪费，而且也污染环境。

发明内容

本发明的目的是提出一种充分利用菠萝皮废弃物，以Gemini表面活性剂反胶束进行高效菠萝蛋白酶提取的方法。

本发明包括以下步骤：

1）制备菠萝蛋白酶粗提液：将干净的菠萝皮与pH值为 5.5～6.5 的磷酸缓冲溶液混合粉粹后，经渣汁分离，取得粗酶液；

2）前萃取：将NaCl浓度为0.05～0.2M、pH值为8～10.5的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液与粗酶液混合后再与反胶束以等体积比混合振荡后，经离心分离取上层有机相；其中，反胶束由季铵盐Gemini表面活性剂和正己烷、正己醇和水混合组成；所述季铵盐Gemini表面活性剂在反胶束中的浓度为0.01g/mL～0.03g/mL；

3）后萃取：将KBr浓度为0.25～1M 、pH值为3.8～4.2的HAC-NaAC缓冲液与有机相等体积比混合振荡后，离心分离取下层水相；

4）冷冻干燥：将下层水相在压强为50±2Pa、温度为-60℃～-55℃下冷冻干燥，得到纯菠萝蛋白酶。

季铵盐Gemini表面活性剂以C_m-s-C_m表示，结构式如下：

上式中，m = 12～16，s = 5～12。

季铵盐Gemini表面活性剂不同于传统表面活性剂，具有两个亲水头基和两条疏水尾链，且两个亲水头基通过一个连接基团以共价键相连。

反胶束是通过表面活性剂将水滴稳定分散在有机溶剂中的分子有序聚集体。本发明采用具有季铵盐Gemini表面活性剂的反胶束对菠萝皮中的菠萝蛋白酶进行萃取，萃取过程中仅需少量的表面活性剂，通过控制前萃液的pH值既能使菠萝皮粗提液中的菠萝蛋白酶转移至反胶束，又能减少表面活性剂对菠萝蛋白酶的污染；通过调节正己烷和正己醇的比例，还能提高菠萝蛋白酶的活性。之后通过控制反萃液的pH值即能使菠萝蛋白酶从反胶束转移并高效地富集在水相中。

本发明操作过程简单，表面活性剂用量低，萃取条件范围广，易于规模化生产，菠萝蛋白酶活性损失少，酶活性回收率较高，萃取后所得菠萝蛋白酶的活性回收率可达163%，纯化倍数可达到4。本发明可极大地增加菠萝皮的利用价值，也能一定程度上减少菠萝废弃物对环境的污染。

另外，正己烷和正己醇的体积比反映了助溶剂正己醇的含量大小，助溶剂的含量过小或过大，都无法取得较高的萃取率和回收率。助溶剂能够插入表面活性剂分子之间，从而减弱表面活性剂分子间的静电斥力。但是当助溶剂浓度过高时，反胶束表面上的助溶剂分子所占的比例过大，会导致反胶束变小，形成空间障碍，以致无法包裹蛋白质分子，最终导致萃取率降低。

水与季铵盐Gemini表面活性剂的摩尔比（ω₀）是反胶束的一个重要参数，随着ω₀的增大，反胶束的水力半径也逐渐增大，使得反胶束的水核增大，但当ω₀增大到一定值时，反胶束因为水的沉积而变得不透明，表明此时过量的水不能再增溶至反胶束。

因此，本发明在反胶束中，优选正己烷和正己醇的体积比为6～9.5:1，水与季铵盐Gemini表面活性剂的摩尔比为10～20：1，以确保前萃取取得更加理想的效果。

所述季铵盐Gemini表面活性剂在反胶束中的优选的浓度为0.025/mL～0.03/mL。此时，萃取后所得菠萝蛋白酶的活性回收率可达163%，纯化倍数可达到4。