[发明专利]鸡肠炎沙门氏菌感染甲基化调控基因的鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物基因工程技术领域，尤其涉及一种鸡肠炎沙门氏菌感染甲基化调控基因的鉴定方法。

背景技术

肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)为革兰氏阴性菌，是一种危害较大的食源性致病菌，感染家禽后，为家禽生产和人类健康带来严重的经济损失和安全隐患。

DNA的甲基化是真核生物主要的表观遗传修饰，是表观遗传学的重要组成部分，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤及相关疾病发生中起着重要作用，异常甲基化的发生是导致疾病的一大关键因素。启动子区域CpG岛(CGI)高甲基化导致免疫基因表达失活是目前疾病研究中的热点课题。

目前，有人比较了不同鸡种生长快慢之间的甲基化差异，或利用MEDIP技术分析了在感染致病型大肠杆菌后鸡脾脏全基因组甲基化变化和表达的关系，微生物在感染哺乳动物后能够通过引起基因的高甲基化而引发各种疾病，而关于肠炎沙门氏菌感染对鸡全基因组甲基化水平影响的报道较少，且尚无关于鉴定在肠炎沙门氏菌感染中发挥甲基化调控基因的报道。

发明内容

本发明的实施例提供一种鸡肠炎沙门氏菌感染甲基化调控基因的鉴定方法，可以鉴定在鸡肠炎沙门氏菌感染中发挥甲基化调控作用的基因。

为达到上述目的，本发明的实施例采用如下技术方案：

一种鸡肠炎沙门氏菌感染甲基化调控基因的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、选择2日龄沙门氏菌阴性鸡，均分为试验组和对照组；所述试验组通过口腔灌服法接种0.3ml肠炎沙门氏菌，接种量为2-4×10⁸cfu/只，所述对照组接种0.3mL的磷酸盐缓冲溶液；

S2、接种14天后，根据感染肠炎沙门氏菌的盲肠内容物细菌含量结果，选择实验组中细菌含量最多的个体3-6个；随机选择对照组中 等数量的个体；被选中的每只鸡的脾脏作为一个样本；

S3、从各个样本中提取DNA，实验组和对照组各构建2个DNA混池，利用DNA的破碎试剂盒将各个DNA混池中的DNA打断至150-800bp的大小不等DNA片段，用T4DNA聚合酶和Klenow酶将得到的所有DNA片段修饰成平末端；

S4、用Agencourt公司的产品AMPure XP磁珠筛选300-400bp的修饰成平末端的DNA片段并纯化；

S5、在筛选出的DNA片段的平末端序列末端加腺嘌呤变成粘性末端；

S6、将筛选出的DNA片段与接头序列连接，采用甲基化DNA沉淀试剂盒对连接完成后的序列样品进行甲基化的DNA富集，验证扩增纯化后进行测序以确定甲基化发生差异的具体基因；

S7、进行数据分析，获得MeDIP-Seq数据产出统计表，如表1所示，从整体水平表示了从样品中收集到全基因组参与测序的独有数据情况，且数据比对到基因组的比例较高，说明数据质量来源可靠，可以进一步分析；图1表示的是每条染色体上DMR所占的百分比，横坐标表示每条染色体(chr)，纵坐标指甲基化差异区域占每条染色体总长的比例，此图能总体简略看出甲基化在整个基因组中所占的比例，除16、21和25号染色体外，DMR在各染色体均有分布，比例较高的是10、11和24号染色体；在表2里，展示了DMR在各个区域的分布情况，通过表2，我们了解到甲基化是发生在包括内含子在内的整个基因组，并非只在转录基因体现，说明甲基化在表观遗传现象起到的作用是通过多个基因位置实现的，如DNA，RNA；图2表示的是甲基化差异显著基因的基因本体论功能分析，在这个表中，我们对差异基因的功能进行聚类分析，全面了解甲基化差异的基因在感染中发挥的作用，筛选出在多个功能类别中存在频率较高的基因，用于进一步鉴定感染中发挥重要作用的基因；表3是对差异基因的信号通路分析，信号通路是指响应某一信息源而执行一定功能的通路，基因在信号通路中发挥各自的作用，参与生物功能代谢等，也作为鉴定基因功能的因素之一；表4是显著差异基因甲基化的倍数变化，表中直观展示了差异上调和下调倍数较大的前22个基因，是筛选基因的主要依据；表5是将所有的差异基因进行本体论分析后，将其所包含的全部基因重复数进行统计后得到的结果，对功能的分析和基因的鉴定有重要的参考价值。

S8、通过对甲基化差异基因的鉴定和对基因的功能和信号通路分析，结合差异基因的甲基化倍数变化，鉴定得出肠炎沙门氏菌感染中发挥甲基化调控的基因。