[发明专利]一种法氏囊病毒效价的测定方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种法氏囊病毒效价的测定方法。

背景技术

一般法氏囊病毒效价的测定流程包括：细胞传代，铺细胞板，病毒稀释，细胞板换液并加病毒液培养，病变观察及结果的判定。

传统方法，细胞消化后按1：3的传代分种比例的细胞来铺板，细胞板培养96小时后，以70％的细胞病变作为判定标准计算病毒效价。这种方法的缺陷在于：每次固定传代比例的细胞密度存在较大的差异，当原方瓶细胞密度大，消化后的细胞密度也大，所以铺板的细胞密度就大，培养24小的细胞密度差异就会较大，而细胞密度会影响病毒效价测定结果的准确性。一般来说，每个细胞有个最小病毒感染量，病毒效价测定过程中，每细胞孔接种的毒量是一定的，按传统的方法每次细胞板中每孔的细胞量差异较大，而判定仍是按细胞病变70％来计算，当细胞数量差异大时，细胞病变至70％的孔数差别就很大，判定的结果差异就很大，就存在同样的样品每次测定结果都不一样，而且差异较大。另一方面，以70％的细胞病变作为判定标准，存在较大的人为的判定差异，不能真正反应样品的效价，难以做到标准化。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种提高测定结果的准确性与稳定性的法氏囊病毒效价的测定方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种法氏囊病毒效价的测定方法，包括以下步骤：

1)细胞传代：将要用于铺板的培养48小时的方瓶细胞倒去培养液，用磷酸盐缓冲液(PBS)将细胞洗两遍后，加入质量浓度为0.25％的胰酶消化液进行消化，然后加入与倒去的培养液等体积的营养液，用移液管吹打混合均匀，得到细胞原液；

2)消化后细胞原液细胞计数及细胞原液的最终稀释：将步聚1)的细胞原液取出一部分，稀释后，加入细胞计数板中进行计数，并换算出细胞原液的密度；

再根据细胞原液的密度，将细胞原液用营养液稀释至细胞密度为2-3×10⁵个细胞/ml的细胞稀释液，待用；

3)铺细胞板并培养：将上述细胞稀释液加入96孔细胞培养板中，每孔加细胞稀释液100ul(即每孔含2-3万个细胞)，然后将细胞培养板置于37℃二氧化碳培养箱中培养24h，待用；

4)病毒的稀释：取法氏囊病毒液，用不含血清的营养液逐步稀释，得到10^-6，10^-7，10^-8的法氏囊病毒稀释液；

5)细胞板换液并加病毒液培养观察：将步骤3)中培养24h的96孔细胞培养板倒去废液，然后将10^-6，10^-7，10^-8的法氏囊病毒稀释液加入96孔细胞培养板中，每个稀释度加6孔，每孔100ul，然后将细胞培养板置于37℃二氧化碳培养箱中培养96h；

6)细胞病变观察及结果判定：上述细胞培养板培养96h后，观察细胞病变，以100％的细胞病变作为判定标准，计算病毒效价TCID₅₀/0.1mL。

所述的步骤1)中胰酶消化液的质量浓度为0.25-0.3％。

所述的步骤1)加入的胰酶消化液完全浸没细胞。

所述的步骤2)具体为：取步聚1)的细胞原液1-1.5ml，稀释3-5倍，然后用移液枪吸取30-35ul稀释后的细胞原液，加入细胞计数板中进行计数，并换算出细胞原液的密度，再根据细胞原液的密度，及加入细胞板的密度(每孔加100ul，含2-3万个细胞，即密度为2-3×10⁵个细胞/ml)进行稀释，稀释好的细胞稀释液待用。

所述营养液是指DMEM(含各种氨基酸和葡萄糖的培养基)粉末，加注射用水配制后过滤，用时再添加10％的血清而成。

病毒稀释所用的营养液，不加血清，因为血清会影响法氏囊病毒吸附到细胞上，影响病毒侵入细胞及后续的细胞繁殖。

所述TCID₅₀/0.1mL的计算方法按《中化人民共和国兽用生物制品规程》中病毒半数致死(感染)量(LD50、EID50、TCID50)的测定方法。