[发明专利]乙型肝炎病毒感染合并酒精性脂肪肝小鼠模型的构建方法

说明书

本发明公开了一种建立慢性乙型肝炎病毒感染合并酒精性脂肪肝小鼠模型的方法。该方法将pGEM4Z/HBV1.3质粒通过高压尾静脉注射于FVB/N小鼠体内，造成小鼠肝脏HBV慢性复制状态，再以含酒精液体饲料喂养5周以上，观察了小鼠肝脏组织学变化和血清学变化，包括谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)及乙肝e抗原(HBeAg)，从而建立模拟人类慢性乙型肝炎病毒感染合并酒精性脂肪肝病理过程的小鼠模型。该模型的建立为系统研究慢性乙型肝炎病毒感染合并酒精性脂肪肝的遗传调控、分子机理及防治措施提供了有力的工具。

技术领域

本发明涉及一种建立慢性乙型肝炎病毒感染合并酒精性脂肪肝小鼠模型的方法，用于模拟、研究和防治人类慢性乙型肝炎病毒感染合并酒精性脂肪肝。

背景技术

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染是一个严重危害人类健康的世界性公共卫生问题，能引起多种肝损害，包括急慢性病毒性肝炎，甚至与肝硬化、肝细胞癌的发生密切相关。全球约有20亿人被证明感染过HBV，目前全世界慢性HBV感染患者至少有3.5亿。我国是乙型肝炎病毒感染的高发地区，全国约1.5亿人是HBV携带者，其中有2000万人为慢性乙肝患者，每年因此病死亡的人数已近50万。在我国，随着社会经济发展、饮食生活习惯的改变，中国酒精消耗量迅速增长，嗜酒者在不到20年内增长了70倍。酒类产量也不断增大；WHO2006年《西太平洋地区减少酒精危害计划》指出中国已成为世界酒精消费的“重灾区”。近年来由酒精所导致肝损伤的发病率亦逐年攀升,酒精已成为继病毒性肝炎之后导致肝损害的第二大病因，该病是我国常见的肝脏疾病之一。而且，不少HBV感染患者由于长期饮酒而导致酒精性脂肪肝和肝炎病毒感染混合存在，起到叠加的致病的作用，更易并发肝硬化及肝癌；因此临床上慢性HBV感染合并酒精性肝病的患者日益增多，这对临床的治疗及预后又带来了新的挑战。因而，深入开展慢性HBV感染合并酒精性肝病的研究可为预测该疾病的衍变和预后以及为该疾病的临床治疗提供理论依据。

HBV感染具有明显的种属特异性，其易感宿主只局限于人及黑猩猩等灵长类动物，因此建立适合于HBV研究的简单、可靠的小动物模型是研究者们一直需要攻克的难关。1969年科学家们首次证实了HBV可以感染黑猩猩，这对HBV的研究起了重要作用，但是黑猩猩价格昂贵，且来源有限，加之其感染HBV后虽有特异性免疫反应产生但并无明显的临床症状，其感染后的经过与转归与人类乙型肝炎有明显的差别，因此研究者们有必要继续寻找其他更易获得且对HBV更加敏感的动物模型。长臂猿类似黑猩猩对 HBV敏感，感染HBV后可出现与人类类似的血清学和生化学改变，但其同样不产生明显的临床症状。绒毛猴感染HBV后虽可产生迟发型HBsAg血症，但临床症状、血清生化和肝组织学无明显变化。恒河猴对HBV的易感性比黑猩猩和长臂猿低，且其只对HBV-adw亚型敏感，但感染动物都缺乏典型临床症状，血清转氨酶活力无明显升高，肝组织也缺乏相应的肝炎病理改变，这些均限制了恒河猴在乙型病毒肝炎研究中的应用。树鼩是一种低等小型灵长类动物，20世纪80年代起，即被用于HBV实验感染动物模型的研究。用人HBV接种树鼩发现肝脏细胞内有病毒DNA的复制，血清中出现HBsAg等HBV标志物，肝细胞显示轻度肝炎病变，血清转氨酶明显升高。但树鼩目前多以野生繁殖为主，捕获后短期饲养便进行实验，实验结果稳定性差。因此对培育驯化成生理指标和条件一致的动物种系仍有待进一步研究。

随着人们对乙型肝炎病毒认识的不断提高，1985年Chisari等科研工作者通过显微注射技术建立了乙型肝炎病毒转基因小鼠模型，该模型主要用于乙型肝炎病毒治疗性免疫制剂的发展和临床效果观察，为乙型肝炎病毒的深入研究提供了新的途径。但也存在一些问题，如转基因小鼠具有遗传不稳定性，小鼠体内缺乏病原体复制，与HBV自然感染人体的状态有所不同。近年来一种新型的技术，即快速大量的经鼠尾静脉注射质粒DNA可以大大提高转染效率，其与转基因鼠比较有两大优势：首先能够进行急性肝炎情况下的免疫反应研究，因HBV-DNA不整合到宿主基因上，也可用该模型进行抗病毒治疗或介导免疫反应后清除病毒复制和感染的研究；第二，许多变异株病毒，包括从患者体内采集的和实验室构建的，可以注入鼠的体内，并在较短的时问内分析其复制能力。