[发明专利]肺癌干细胞条件3D培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种条件3D细胞培养方法，是一种可以高效分离和扩增肺癌干细胞的方法，可用于建立肿瘤创新药物的体外筛选系统。

技术背景

肺癌是目前在全世界范围内发病率及病死率均居前列的恶性肿瘤，严重威胁人类健康，其中非小细胞肺癌（NSCLC）约占肺癌的80%-85%。近年来随着手术技术的进步和规范的放化疗方案的推广，NSCLC的临床治疗水平有了很大提高，但NSCLC的5年生存率并未得到有效改善。究其原因，除了NSCLC高侵袭性和易复发的恶性特征外，临床药物治疗的局限性也是制约NSCLC治疗效果的重要因素。人类对NSCLC发生和发展分子机制的深入认识为创新药物开发筛选出众多有价值的分子靶点，但大多数备选创新药物无法在临床试验中重复出临床前体外实验的满意疗效，因此大大限制了NSCLC创新药的研发速度和临床治疗效果。

导致上述现象的主要原因是现有药物筛选系统中常用的体外肿瘤细胞模型难以模拟体内肿瘤组织的生长方式和行为特点，因此导致临床试验结果与前期体外实验结果大相径庭。临床前体外肿瘤细胞模型通常建立在传统2D细胞培养基础上，这种培养方法使细胞单层贴壁生长，彼此接触，互相抑制，难以模拟体内肿瘤立体生长模式，不易形成促肿瘤生长的局部微环境，因此也无法如实反映体内肿瘤的生物学行为和对药物的反应性。此外，传统2D细胞培养方法不适合肿瘤组织中具有极强致瘤性的肿瘤干细胞的生长和扩增。肿瘤干细胞是肿瘤中很小一部分具有促进肿瘤发生、维持肿瘤生长和保持肿瘤异质性的细胞，具有自我更新、多向分化和无限增殖潜能，携带独特的干细胞标志。目前越来越多研究证实肿瘤干细胞是导致肿瘤耐药和复发转移的关键原因，而且由于其具有对化疗药物的天然耐受性，也是肿瘤获得性耐药的主要原因之一。因此，建立富含肿瘤干细胞的体外肿瘤细胞模型有助于筛选出具有更强抗肿瘤活性、较低药物抵抗性，有效控制疾病进展和肿瘤转移复发的肿瘤创新药物。但由于肿瘤干细胞在肿瘤细胞内数量极少，且多处于静止期，利用传统2D细胞培养很难在体外进行有效的分离和扩增，因此也难以建立适合肿瘤创新药物筛选的肿瘤干细胞体外药理学模型。

文献证实，在癌症研究中3D细胞培养方法可以弥补2D细胞培养无法模拟细胞体内生存环境的缺陷，并可实现肿瘤干细胞的体外分离和扩增。3D细胞培养方法是通过立体培养模式为肿瘤细胞提供一个更加接近体内生存条件的微环境：首先，肿瘤细胞在3D细胞培养系统中呈克隆团相互隔离生长，彼此之间不会发生接触抑制；其次，3D细胞培养系统的基质胶内部互通，肿瘤细胞生长过程中各种细胞因子和可溶性化学物质可以自由交流，形成类似体内肿瘤微环境的局部生存环境，促进肿瘤细胞，尤其是肿瘤干细胞的增殖；最后，3D细胞培养系统中肿瘤细胞呈立体而非平面分布，更接近体内肿瘤团块的形态，因此更便于独立研究创新药物对肿瘤细胞中信号通路、生物学功能的影响，使药物反应更加接近体内实际应用的情况。目前，3D细胞培养方法不仅应用于细胞的高通量药物筛选、毒物筛选及其它筛选，还可以应用于多种体内环境模拟实验。

发明内容

本发明的目的是为了解决肿瘤干细胞在肿瘤细胞内数量极少，且多处于静止期，利用传统2D细胞培养很难在体外进行有效的分离和扩增，因此也难以建立适合肿瘤创新药物筛选的肿瘤干细胞体外药理学模型的问题，而提供一种高效分离和扩增肺癌干细胞的条件3D培养方法。

本发明是按照以下技术实现的。

一种肺癌干细胞条件3D培养方法，其方法为：

将人肺腺癌细胞系A549用含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基，置于37℃、5%CO₂、相对湿度90%的培养箱中培养，取对数生长期细胞悬液，调整细胞浓度为5×10⁴个细胞/ml，取200μL（1×10⁴个细胞）/孔加到已铺好50μL/孔伊格尔基础培养基（BME）的96孔板里；于第3天，用含25～75 ng/ml胰岛素样生长因子-1和10～30ng/ml成?纤?维?细?胞?生?长?因?子的RPMI-1640完全培养基给A549细胞换液，37℃、5%CO₂条件下继续培养4天；经中性金属蛋白水解酶（Dispase，BD^TM，354235）消化BME、回收液（Cell Recovery Solution，BD^TM，354253）回收A549细胞，最后进行细胞增殖、自我更新、干细胞标志物鉴定、侵袭转移活性和耐药性检测等一系列的干细胞鉴定实验。