[发明专利]一种用于抑制肿瘤细胞生长的基因表达元件及其应用

说明书

技术领域

本发明属于肿瘤基因治疗技术领域，具体涉及一种用于抑制肿瘤细胞生长的基因表达元件及其应用。

背景技术

恶性肿瘤是严重危害人类健康的疾病之一，其治疗耗费了大量的医疗资源，手术、化疗和放疗等常规方式的疗效和预后均不理想，因此，研究探索新的癌症治疗方法具有重要意义。

新兴的肿瘤生物治疗方法目前已经在临床开始应用，对放化疗无效的恶性肿瘤的治疗显示出其独特的优势，展现出了良好的应用前景。其中肿瘤基因治疗始终是肿瘤生物治疗的主要方向之一。

靶向性是肿瘤基因治疗一个非常重要的方面，即在特异性杀伤肿瘤细胞的同时对正常细胞没有伤害。利用肿瘤特异性启动子，使目的基因只在肿瘤细胞内特异性表达而在其它细胞中不表达，是靶向性基因治疗的主要手段之一。

在靶基因的选择方面，目前的基因治疗研究大都仅针对那些在正常和肿瘤细胞中表达差异明显的个别靶基因(如失活的抑癌基因、异常激活的癌基因、过表达的抗凋亡基因、各种microRNA等)。然而，肿瘤的发生发展涉及众多基因，仅仅针对一个或几个表达差异的基因虽能在一定程度上纠正肿瘤细胞的某些恶性表型，显示出一定的体内外抑瘤效应，但因针对个别靶基因的抑瘤效率以及载体导入的靶向性、目的基因表达的可调控性等较多的问题而使这些基因治疗手段无法在临床上发挥更好的疗效，甚至大部分难以进入临床。因此，探索、尝试新的提高基因治疗药物的靶向性和体内抑瘤的有效性的肝癌基因治疗方法具有十分重要的意义。

肿瘤细胞具有快速生长和增殖的特性，而任何细胞的增殖都需要经过染色体复制这一细胞内独一无二的重要基本环节。通过抑制DNA聚合酶的表达，可以使肿瘤细胞无法进行染色体复制，进而无法增殖。

如公开号为CN 10168654 A的中国专利公开了一种癌胚抗原阳性细胞靶基因表达元件CPD，该基因表达元件导入CEA阳性的肿瘤细胞后，可以在细胞中表达针对DNA聚合酶δ催化亚基p125的人工microRNA，抑制DNA聚合酶δ催化亚基p125的表达，进而影响DNA复制，抑制细胞增殖。

真核细胞中负责DNA合成的DNA聚合酶主要有α、δ、ε三种，而现有用于抑制DNA聚合酶表达的肿瘤靶向性基因表达元件中，其携带的microRNA均靶向单一的DNA聚合酶，其阻断DNA复制的效果不够理想。并且，仅仅阻断肿瘤细胞的增殖还不能杀死肿瘤细胞，难以根治癌症。

发明内容

本发明公开了一种用于抑制肿瘤细胞生长的基因表达元件，该基因表达元件不仅能有效阻断肿瘤细胞增殖，还能诱导肿瘤细胞凋亡。

一种用于抑制肿瘤细胞生长的基因表达元件，由第一表达框和第二表达框组成，所述第一表达框由肿瘤特异性启动子、分别靶向DNA聚合酶α、δ、ε的三种mircoRNA的编码序列以及转录终止信号序列依次连接而成；所述第二表达框由肿瘤特异性启动子、凋亡因子基因以及转录终止信号序列依次连接而成。

一方面，本发明以染色体复制必需的DNA聚合酶α、δ、ε三个酶基因为靶点，对它们的表达同时进行有效抑制，使得肿瘤细胞因缺乏这三种DNA聚合酶而无法进行染色体复制，进而无法增殖；另一方面，本发明利用凋亡因子促进停止增殖的肿瘤细胞凋亡，最终达到较为彻底的基因治疗的目的。将mircoRNA的编码序列和凋亡因子置于两个单独的表达框分别转录，避免相互干扰。

针对不同的肿瘤细胞，可以选择不同种类的肿瘤特异性启动子，如甲胎蛋白启动子、癌胚抗原启动子或前列腺特异性抗原启动子。其中，甲胎蛋白启动子(AFP启动子)可以靶向肝细胞性肝癌细胞，癌胚抗原启动子(CEA启动子)可以靶向CEA阳性的肠癌、肺癌细胞，前列腺特异性抗原启动子(PSA启动子)可以靶向PSA阳性的前列腺癌细胞。

当选用AFP启动子时，其核苷酸序列优选为如SEQ ID No.1所示。该序列的AFP启动子中包含人AFP基因的-4120至-3300区的增强子区域和-180至+1区的基本启动子区域，其中，该增强子区域中带有多个肝细胞特异性转录因子结合位点，可以较大幅度地特异地提高AFP启动子的表达效率。

作为优选，靶向DNA聚合酶α的mircoRNA的编码序列如SEQ ID No.2所示，靶向DNA聚合酶δ的mircoRNA的编码序列如SEQ ID No.3所示，靶向DNA聚合酶ε的mircoRNA的编码序列如SEQ ID No.4所示。