[发明专利]一种中和肠道病毒71型嵌合单克隆抗体的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种识别肠道病毒71型及柯萨奇病毒A16型VP4蛋白的单克隆抗体及其制备方法与应用，特别涉及一种将EV71VP4蛋白嵌合到HBcAg病毒样颗粒中制备而成的融合蛋白，将其作为抗原免疫Balb/c小鼠。利用噬菌体展示抗体文库技术筛选获得能特异性中和EV71VP4蛋白的单克隆抗体。

背景技术

手足口病(Hand foot mouth disease，HFMD)是由不同的肠道病毒所引起的婴幼儿常见的传染病，以发热和手、足、口等部位出现疱疹为特征，少数患儿出现中枢神经系统损伤、肺水肿、肺出血、循环衰竭及心脏损害，个别因严重并发症致死。近几十年来，手足口病已在全世界多个地区爆发和流行，累及地区之广，发病人数之多，引起人们高度重视。2008年1月1日至2011年10月31日止，全国感染手足口病近476万例，造成1821名患儿死亡。在2008年我国将手足口病列入法定报告管理的丙类传染病，要求在24h之内上报卫生部。引起手足口病的肠道病毒分为肠道病毒71(Enterovirus 71，EV71)、埃可病毒(ECHO)、柯萨奇病毒(Coxsackievirus)A型与B型等，其中以EV71及CVA16型最为常见。通常情况下，EV71与CVA16引起的手足口病在临床症状等方面难以区别，但EV71易致无菌性脑膜炎、脑干脑炎和脊髓灰质炎样麻痹等多种神经系统相关性疾病，可危及生命。

肠道病毒71型(enterovirus 71，EV71)属于小RNA病毒科(Picornaradae)肠道病毒属(Enterovirus)，分子量约为2.6×10⁶D，约由7389～7408个核苷酸组成的。柯萨奇病毒A16型(Coxsackievirus A16，CVA16)亦属于小RNA病毒科，病毒基因组为约7410b的单链RNA。EV71与/或CVA16毒粒为二十面体形，立体对称，呈球形状，是裸露的核衣壳，直径约为23-30nm，无包膜。

EV71与/或CVA16病毒的衣壳蛋白由VP1、VP2、VP3和VP4组成，四种结构蛋白中，VP1、VP2和VP3裸露于病毒颗粒的表面，而VP4则位于病毒颗粒衣壳的内表面与RNA核心紧密相连。根据病毒衣壳蛋白VP1核苷酸序列的 不同，可将EV71分为A、B、C三个基因型，其中B型分为B1-B5亚型，C型分为C1-C4亚型，不同亚型感染后临床症状不完全相同。传统意义上认为病毒的抗原决定簇基本上位于VP1-VP3上(Cardosa M J,Perera D,Brown B A,et al.Molecular epidemiology of humanenterovirus 71strains and recent outbreaks in the Asia-Pacific region:comparative analysis of the VP1and VP4genes[J].Emerg Infect Dis,2003,9(4):461-468.)。有研究发现EV71VP4序列N-末端的前20个氨基酸是高度保守的，该段基因融合HBcAg形成的嵌合病毒样颗粒(命名为HBcAg-VP4)有中和活性的产生，并且能够引起针对不同EV71基因型以及CVA16的交叉中和抗体反应。