[发明专利]一种中和肠道病毒71型嵌合单克隆抗体的制备方法

权利要求书

1.一种中和肠道病毒71型嵌合单克隆抗体或其片段，其特征在于：所述的单克隆抗体或其片段的轻链可变区具有SEQ ID NO：1所示的基因序列，

所述的单克隆抗体或其片段的重链可变区具有SEQ ID NO：2所示的基因序列，

所述的单克隆抗体或其片段包括可变区和恒定区，所述恒定区的人IgG1kappa轻链恒定区具有SEQ ID NO：3所示的基因序列；所述恒定区的人IgG1重链恒定区具有SEQ ID NO：4所示的基因序列。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其片段，其特征在于：

所述的单克隆抗体或其片段包括ScFv或Fab形式。

3.一种制备如权利要求1所述的单克隆抗体或其片段的方法，其特征在于步骤如下：

1)针对EV71VP4蛋白N-末端的前20个氨基酸序列融合HBc蛋白形成嵌合病毒样颗粒，命名为HBcAg-VP4蛋白；利用已经获得的HBcAg-VP4蛋白免疫6-8周龄的Balb/c小鼠，取小鼠脾脏组织，研磨得到细胞，分离淋巴细胞，Trizol法提取mRNA；

2)将步骤1)提取的mRNA反转录成cDNA，PCR反应扩增抗体可变区的轻链基因片段V_L与重链基因片段V_H，并利用重叠PCR拼接成V_L-Linker-V_H形式的ScFv单链抗体基因片段，经Sfi I和Not I双酶切后插入到噬菌粒载体pCANTAB5E中，连接获得重组质粒pCANTAB5E-ScFv，转化TG1感受态细菌；

3)将步骤2)中已转入重组质粒pCANTAB5E-ScFv的TG1细菌继续扩大培养，加入M13K07辅助噬菌体，组装并释放能够在噬菌体表面融合表达ScFv单链抗体片段的噬菌体，即噬菌体展示文库；利用ELISA法，得到与EV71-C4型病毒抗原蛋白结合的噬菌体展示文库，即阳性噬菌体展示文库，其表面展示了具有中和EV71病毒活性的阳性抗体蛋白；

4)克隆已筛选的阳性抗体的可变区轻链基因片段V_L与重链基因片段V_H，克隆人类抗体IgG轻链恒定区基因片段HC_L与重链基因片段HC_H，利用重叠PCR将阳性抗体的V_L与HC_L拼接并插入到pcDNA3.1/zeo(+)表达载体中，得到重组质粒pcDNA3.1/zeo-L；将V_H与HC_H拼接并插入到pcDNA3.1(+)表达载体中，得到重组质粒pcDNA3.1-H；分别转化TOP10 感受态细菌，筛选阳性菌并扩大培养，提取重组质粒，鉴定阳性克隆；利用用于表达完整单克隆抗体A-M的重组质粒pcDNA3.1/zeo-L与pcDNA3.1-H共转染哺乳动物细胞，纯化得到单克隆抗体A-M；

5)将步骤4)中纯化后的抗体进行体外中和试验，检测抗体中和EV71-C4型病毒的能力，计算获得步骤4)中获得的鼠源单克隆抗体A-M的中和效价，筛选得到能够中和EV71-C4型病毒的鼠源单克隆抗体A-M001。

4.一种重组质粒，包括有SEQ ID NO：1与SEQ ID NO：2的基因序列。

5.一种表达载体，所述载体包含如权利要求1任一项所述单克隆抗体的序列，所述载体为pcDNA3.1/zeo-L与pcDNA3.1-H。

6.一种宿主细胞，转染权利要求5所述的载体，所述的宿主细胞为CHO细胞或293细胞。

7.一种药物，所述药物含有如权利要求1任一项所述单克隆抗体。