[发明专利]一种交通性脑积水的基因检测方法

说明书

技术领域

    本发明涉及一种检测方法，特别是交通性脑积水的基因检测方法。

背景技术

    脑积水分为交通性脑积水和非交通性脑积水，正常人的脑脊液的形成和吸收是一个动态的平衡过程。脑脊液的形成是由侧脑室的脉络丛产生的，脉络丛产生的脑脊液经过其他脑室，经过小脑与脑桥的间隙流到蛛网膜下腔，经过蛛网膜下腔的血管重新吸收，以达到平衡。如果脉络丛产生的脑脊液过多或者蛛网膜下腔发生纤维化，就会导致交通性脑积水，先天性的交通性脑积水患儿起初没有明显的临床表现，随着脑脊液的增多，患儿表现为明显的头围增大，语言认知能力受到影响，肢体瘫痪；患儿需要做脑脊液分流手术，即从侧脑室分流过多的脑脊液经导管到腹腔中进行治疗；因此对患儿的早期诊断非常重要，可以实现早诊断早治疗；当前的诊断主要是核磁共振扫描技术，通过对病人脑部扫描，确定Evan比例，即侧脑室最宽的部分与脑部最宽的部分的比例，如果大于0.3即为脑积水，但核磁共振扫描所需费用高, 对病人体动敏感，易产生伪影，扫描时间长,部分病人会有幽闭恐惧症；而且当用核磁共振技术扫描后判断的脑积水是要等到病人发病甚至病重后才能被确诊，这样很不利于病情的控制，而脑积水病人如果早诊断早治疗的话会有效控制病情，因此，重点研发新的简单迅速费用低廉灵敏度高，特异性强，可早期诊断的交通性脑积水的体外基因检测方法，对于交通性脑积水患者提前预警及采取有效的治疗手段意义重大。

发明内容

  本发明的目的是提供一种可以取样方便，灵敏度高，特异性强，可早期诊断的基因检测方法。

  一种交通性脑积水的基因检测方法，以TGF-β1的特异性核酸定量标准品为对照，即TGF-β1的部分序列: 5'-gagcagcggaccgaggaccagacgcggatctccgtagaacaggaggaaatggagtacttcgccaaggtgccgcacaagttcaacatgagtataaacagtacagcaatcatggggaacaaaaatgtcgcagttcccttcaacatatctgagatacgacaaagtgtcgggaaataccaccagctaaccagcgcagagttgcggattcacatcaagaaacctatgatactcgaagaccaacgggtggaactctactacggtctggacccctcagctcgatacctcactactcgcttaatcaataacaagatgaaagacaaatggatttcctttgatgtgacagaacctctacggaaatggctt-3',直接用待测病人的静脉血为样本,其特征在于,包含以下方法步骤:

（1）提取RNA

采取待测病人一定量的标本经前处理,按照常规方法提取RNA,气干后加入10ulDEPC 水溶液溶解RNA；

（2）荧光PCR扩增

取定量荧光扩增试剂，加入适量DNA聚合酶与防污的尿嘧啶糖基酶，逆转录酶于薄壁试管中，混匀，3000rpm离心数秒，取上述混合液于薄壁管中，同时至少预备两份装有上述混合液的管，一份加入步骤一制备的RNA溶液，另一份加入已经标定的标准品作为对照，立即进行聚合酶链式扩增反应；

（3）荧光扩增

 样品反应管及对照标准品反应管置于定量荧光PCR仪检测，设置循环条件，进行荧光检测；

（4）结果分析

 选择荧光检测模式FAM荧光，基线调整6-16个循环的荧光信号；阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点；荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，判断为阳性。

   所述的步骤（2）荧光PCR扩增中，荧光扩增检测试剂包括一步法RT-PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物、特异扩增引物及特异性探针；所述的特异扩增引物是：

引物S1：引物序列为5’-atgaggctgactctcttgac- 3’

引物S2:引物序列为5’ -agctacacttgcaatacttc-3’

所述的特异性探针是

探针S3：探针序列为5’-R-agtcagatcctcagcaagct-Q-3’

其中R为报告基因，Q为 淬灭荧光基因。

所述的检测方法，其特征在于所述的荧光扩增检测试剂为由下列组分以双蒸水为溶剂混合而成：

一步法RT-PCR缓冲液：

500mM氯化钾、100mM Tris-Cl、15mM氯化镁、0.1mg/ml 聚乙二醇6000、0.1% 1,4-二巯基苏糖醇、1%g/ml 牛血清白蛋白，