[发明专利]一种交通性脑积水的基因检测方法

权利要求书

1.一种交通性脑积水的基因检测方法，以TGF-β1的特异性核酸定量标准品为对照，即TGF-β1的部分序列: 5'-gagcagcggaccgaggaccagacgcggatctccgtagaacaggaggaaatggagtacttcgccaaggtgccgcacaagttcaacatgagtataaacagtacagcaatcatggggaacaaaaatgtcgcagttcccttcaacatatctgagatacgacaaagtgtcgggaaataccaccagctaaccagcgcagagttgcggattcacatcaagaaacctatgatactcgaagaccaacgggtggaactctactacggtctggacccctcagctcgatacctcactactcgcttaatcaataacaagatgaaagacaaatggatttcctttgatgtgacagaacctctacggaaatggctt-3',直接用待测病人的静脉血为样本,其特征在于,包含以下方法步骤:

（1）提取RNA

采取待测病人一定量的标本经前处理,按照常规方法提取RNA,气干后加入10ulDEPC 水溶液溶解RNA；

（2）荧光PCR扩增

取定量荧光扩增试剂，加入适量DNA聚合酶与防污的尿嘧啶糖基酶，逆转录酶于薄壁试管中，混匀，3000rpm离心数秒，取上述混合液于薄壁管中，同时至少预备两份装有上述混合液的管，一份加入步骤一制备的RNA溶液，另一份加入已经标定的标准品作为对照，立即进行聚合酶链式扩增反应；

（3）荧光扩增

 样品反应管及对照标准品反应管置于定量荧光PCR仪检测，设置循环条件，进行荧光检测；

（4）结果分析

 选择荧光检测模式FAM荧光，基线调整6-16个循环的荧光信号；阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点；荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，判断为阳性；

   所述的步骤（2）荧光PCR扩增中，荧光扩增检测试剂包括一步法RT-PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物、特异扩增引物及特异性探针；所述的特异扩增引物是：

特异性扩增引物引物S1：引物序列为5’-atgaggctgactctcttgac- 3’

特异性扩增引物引物S2:引物序列为5’ -agctacacttgcaatacttc-3’

所述的特异性探针是

探针S3：探针序列为5’-R-agtcagatcctcagcaagct-Q-3’

其中R为报告基因，Q为 淬灭荧光基因。

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述的荧光扩增检测试剂为由下列组分以双蒸水为溶剂混合而成：

一步法RT-PCR缓冲液：

500mM氯化钾、100mM Tris-Cl、15mM氯化镁、0.1mg/ml 聚乙二醇6000、0.1% 1,4-二巯基苏糖醇、1%g/ml 牛血清白蛋白，

脱氧三磷酸核苷dNTP混合物 含量100-400uM，

特异性扩增引物S1 含量0.06-1.3 uM，

特异性扩增引物S2含量0.06-1.3uM，

特异性探针S3含量0.06-0.8 uM，

余量为双蒸水。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述的检测方法步骤（2）荧光PCR扩增为：

取35ul荧光扩增检测试剂，加入0.4ulDNA聚合酶与防污的尿嘧啶糖基酶，1ul逆转录酶于薄壁试管中，混匀，3000rpm离心数秒，取上述混合液于管中，同时预备两份装有上述混合液的管中，一份加入步骤一制备的RNA 溶液4ul,另一份加入已标定好的标准品作对照，立即进行聚合酶链扩增反应：

所述的检测方法步骤（3）荧光检测为：

样品反应管与对照标准品管置于定量荧光PCR仪检测，在仪器推荐循环条件设置：45℃持续30min；升温95℃持续5min；再94℃持续10sec；降温55℃持续12sec；升温72℃持续10sec，循环10次；再按93℃持续10sec；降温至58℃持续45sec，循环40次；单点荧光检测在60℃；推荐循环条件设置：45℃持续20min；升温94℃持续2min；按93℃持续2sec；降温55℃持续15sec；升温72℃持续12sec，循环50次；单点荧光检测在55℃。