[发明专利]一种基于Mo Hsp70蛋白的间接ELISA试剂盒及使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是一种基于Mo Hsp70蛋白的间接ELISA试剂盒及使用方法。

背景技术

绵羊肺炎支原体（Mycoplasma ovipneumoniae，Mo）是引起山羊和绵羊间质性肺炎（非典型肺炎）的病原体，可致山羊及绵羊发生咳嗽、流鼻涕、渐进性消瘦和增生性间质性肺炎症状（张双翔等，2013；冉双存，2010；韩笑，2013）。Mo于1963年首次由Mackay等从苏格兰发病绵羊病肺组织中分离到病原后（Mackay等，1963），西班牙、澳大利亚、新西兰、匈牙利、冰岛、英国、非洲许多国家相继报道Mo引起绵羊和山羊疾病的发生（许健等，2012）。我国自1978年从新西兰引进种羊中首次发现该病原后（胡景邵等，1982），又相继在甘肃、宁夏、云南、贵州等多个省份有相关报道（张双翔等，2013；陆承平，2008；Falah M等，1997；Yang F等，2011），对养羊业的危害日趋严重。

  对绵羊肺炎支原体的防控，目前主要依靠药物预防，尚缺乏可靠的疫苗，究其原因与Mo分离培养费时费力及基因组研究缓慢有关（候相山等，2006；赵萍等，2008）。且目前缺乏疫病检测与防控所需的快速血清学检测手段，尤其可高通量检测、敏感性高的ELISA方法。Hsp70是支原体中具有高度保守性的生物大分子，由于它的免疫原性以及免疫佐剂效应而受到广泛关注（Falah M等，1997；张建华等，2011；李嫒等，2008；Li M等，2011）。研究发现，Hsp70一般结构包含两个区域，分别是主要作用在于分子伴侣作用的N端，以及主要表现为免疫原和免疫佐剂作用的C端，可选择作为核酸疫苗研究及检测技术建立的目标蛋白（乔祖建等，2008；刘茂军等，2011）。而Hsp70蛋白较大（65~70Ku），全基因表达易形成包涵体，影响表达效率，选用其相对稳定C末端基因可有效检测该蛋白的抗原性等特征（刘茂军等,2011；孙悦等，2013）。基于上述问题，本研究构建包含Mo Hsp70蛋白C末端基因的原核表达载体，并建立基于表达产物Mo Hsp70蛋白的间接ELISA方法。为本病的早期检测、疫苗免疫效果评价及相关研究工作提供关键技术，对本病原所致疫病的早发现早防控具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种基于绵羊肺炎支原体Hsp70蛋白的间接ELISA试剂盒及其使用方法，它为Mo引起的山羊和绵羊间质性肺炎疫病的早期监测、免疫效果评价提供关键技术，对本病原所致疫病的早发现早防控具有重要意义。

本发明是这样实现的：基于绵羊肺炎支原体Hsp70蛋白的间接ELISA试剂盒，包被酶标板2个，Mo标准阳性血清1mL、Mo标准阴性血清1mL、酶标二抗300-500μL、50×PBST缓冲液20-25mL、底物液A10mL-15mL、底物液B10mL-15mL和终止液10mL-15mL；所述的包被酶标板为重组蛋白包被，重组蛋白为Mo Hsp70基因通过大肠杆菌Rosseta（DE3）表达系统获得Hsp70重组蛋白，并通过镍柱法进行重组蛋白纯化，使用包被缓冲液稀释为1.0μg/100 μL ~2.5μg /100μL。

所述酶标二抗为兔抗羊IgG-HRP，按1:2000稀释使用。

所述50×PBST缓冲液的制备是： NaCl 400.0 g、KCl 10.0 g、KH₂PO₄ 10.0 g、Na₂HPO₄·12H₂O 145 g、Tween-20 25 mL溶于400 mL蒸馏水，调整pH为7.2～7.6，定容至1000 mL。

Mo标准阳性血清为自制高免血清，使用时按1:5稀释；所述的Mo标准阴性血清自制，使用时按1:5稀释。

所述封闭缓冲液为：脱脂奶粉0.3～0.7 g溶于100 mL PBST缓冲液。

所述底物液A的制备是：将磷酸氢钠14.60 g、柠檬酸 9.33 g及过氧化氢脲 0.52 g，溶于三蒸水中，并定容至1000 mL，调至 p H 5.0～5.4。

所述底物液B的制备是：将TMB 20mg中加入无水乙醇10 mL，再加双蒸水至1000 mL，过滤除菌，无菌分装。

所述终止液为0.2 %～0.3% HF溶液。

所述的间接ELISA试剂盒的使用方法，它包括以下使用步骤：