[发明专利]一种基于Mo Hsp70蛋白的间接ELISA试剂盒及使用方法

权利要求书

1.一种基于绵羊肺炎支原体Hsp70蛋白的间接ELISA试剂盒，其特征在于：包被酶标板2个，Mo标准阳性血清1mL、Mo标准阴性血清1mL、酶标二抗300-500μL、50×PBST缓冲液20-25mL、底物液A10mL-15mL、底物液B10mL-15mL和终止液10mL-15mL；所述的包被酶标板为重组蛋白包被，重组蛋白为Mo Hsp70基因通过大肠杆菌Rosseta（DE3）表达系统获得Hsp70重组蛋白，并通过镍柱法进行重组蛋白纯化，使用包被缓冲液稀释为1.0μg/100 μL ~2.5μg /100μL。

2.如权利要求1所述的间接ELISA试剂盒，其特征在于：所述酶标二抗为兔抗羊IgG-HRP，按1:2000稀释使用。

3.如权利要求1所述的间接ELISA试剂盒，其特征在于：所述50×PBST缓冲液的制备是： NaCl 400.0 g、KCl 10.0 g、KH₂PO₄ 10.0 g、Na₂HPO₄·12H₂O 145 g、Tween-20 25 mL溶于400 mL蒸馏水，调整pH为7.2～7.6，定容至1000 mL。

4.如权利要求1所述的间接ELISA试剂盒，其特征在于：Mo标准阳性血清为自制高免血清，使用时按1:5稀释；所述的Mo标准阴性血清自制，使用时按1:5稀释。

5.如权利要求1所述的间接ELISA试剂盒，其特征在于：所述封闭缓冲液为：脱脂奶粉0.3～0.7 g溶于100 mL PBST缓冲液。

6.如权利要求1所述的间接ELISA试剂盒，其特征在于：所述底物液A的制备是：将磷酸氢钠14.60 g、柠檬酸 9.33 g及过氧化氢脲 0.52 g，溶于三蒸水中，并定容至1000 mL，调至 p H 5.0～5.4。

7.如权利要求1所述的间接ELISA试剂盒，其特征在于：所述底物液B的制备是：将TMB 20mg中加入无水乙醇10 mL，再加双蒸水至1000 mL，过滤除菌，无菌分装。

8.如权利要求1所述的间接ELISA试剂盒，其特征在于：所述终止液为0.2 %～0.3% HF溶液。

9.一种如权利要求1所述的间接ELISA试剂盒的使用方法，其特征在于：它包括以下使用步骤：

1）以1.0μg /100 μL～2.5μg /100μL重组Mo Hsp70蛋白包被酶标板，室温过夜后，应用PBST洗涤ELISA反应板5次；

2）以0.3g/100mL～0.7g/100mL的脱脂奶粉溶液封闭ELISA反应板，37℃，封闭1h-3h后，应用PBST洗涤ELISA反应板5次；4℃保存备用；

3）将阴、阳性对照血清及待检血清做1∶5倍稀释，按100μL加入酶标板反应孔中，37℃孵育1h后，应用PBS洗涤ELISA酶标板各反应孔5次；

4）将兔抗羊IgG-HRP用PBST做1:2000倍稀释，按100μL加入酶标板反应孔，37℃作用1h后，应用PBST洗涤酶标板反应孔5次；

5）将底物液A和B各50μL加入ELISA反应板，避光室温显色10~15min，加入50μL终止液，立即在酶标仪630nm波长下读取OD值；

6）试验成立条件为阳性血清OD630平均值≥1.25，阴性血清OD630平均值＜0.35；试验结果判定标准为待检样本OD₆₃₀值≥0.588为阳性，待检样本OD₆₃₀值＜0.588为阴性。