[发明专利]杂交瘤细胞BPA‑4C7及其产生的双酚A单克隆抗体

说明书

技术领域

本发明涉及杂交瘤细胞株BPA-4C7及其产生的双酚A单克隆抗体。

背景技术

双酚A(Bisphenol A，BPA)是一种具有雌激素活性的物质，会扰乱人体内的代谢过程。双酚A能引起生殖器官异常、使雄性雌性化，还可能诱发某些癌症。从2011年3月1日起已被欧盟禁止在生产婴儿奶瓶的塑料中使用，中国从2011年6月1日起禁止生产含双酚A的婴幼儿奶瓶。双酚A是重要的化工原料，是制造聚碳酸酯、环氧树脂、聚树脂等的前体物质，广泛用于食品包装材料、容器内壁涂料等日常生活中经常接触的材料，可通过包装容器和塑料薄膜渗入食品或饮料进行体内。即使很低的剂量BPA也能使动物产生雌性早熟、精子数下降、前列腺增长等。BPA还具有一定的胚胎毒性和致畸性，可明显增加动物卵巢癌、前列腺癌、白血病等癌症的发生。

目前，食品包装材料及食品中双酚A以痕量水平存在，因此其检测技术主要采用精密仪器分析法进行。检测方法主要采用液相色谱法、气相色谱－质谱法以及液相色谱－串联质谱法。这些方法测定的准确度较高，重复性较好，但需配备大型较昂贵的设备，费用高，对操作人员要求高。酶联免疫法集合了抗原抗体反应的高特异性与酶促反应的高度敏感性。这种方法具有检测范围宽、灵敏度高、特异性好、成本低、对操作人员要求也低。但要研究建立针对双酚A(BPA) 的任何一种免疫学检测技术，都必须先获得抗双酚A(BPA)的抗体。

发明内容

本发明所要解决的问题是提供杂交瘤细胞株BPA-4C7及其产生的双酚A (BPA)的单克隆抗体。

本发明提供了杂交瘤细株BPA-4C7，该细胞株已于2014年12月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是，中国，北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号 ，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.10201分类命名为S/P20 杂交瘤细胞。

抗双酚A单克隆抗体由保藏编号为CGMCC NO.10200的杂交瘤细胞株BPA-4C7分泌产生。该BPA单克隆抗体可以识别双酚A，对双酚A的50％抑制浓度IC50为0.28μg/L。

抗双酚A单克隆抗体在双酚A测定中的应用。

本发明提供的杂交瘤细胞株BPA-4C7单克隆抗体是采用三步法筛选获得的，其具体步骤是：以BPA在4-溴丁酸乙酯作用下生成BPA羧酸酯，再水解生成BPA羧酸，在EDC和NHS存在的条件下和BSA偶联生成BPA-BSA。用其免疫BLAB/c小鼠4次，最后一次加强免疫用2倍与前一次免疫剂量的BPA-BSA，免疫3天后进行细胞融合。采用ELISA分两步法进行筛选融合细胞：第一步采用间接ELISA法筛选出仅能抗双酚A而不抗载体蛋白BSA的阳性克隆；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性克隆培养液进行检测，采用BPA 作为竞争源，选择吸光度值低、灵敏度较高的阳性克隆进行有限稀释法继续克隆，克隆10天后采用同样的两步筛选法进行抗体检测，如此重复2次，最终筛选获得的杂交瘤细胞BPA-4C7。

本发明提供的双酚A单克隆抗体的制备方法，步骤如下：将获得的杂交瘤细胞株BPA-4C7注射预先用弗氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，纯化处理后获得抗双酚A的单克隆抗体。

上述纯化方法的具体操作为：腹水于4℃，3000r/min离心5min以上，吸取上清，将上清与2倍体积的醋酸盐缓冲液混合，边搅拌边缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为33μL，室温混合30min，4℃静置2h以上，使其充分沉淀。然后4℃，12000r/min离心30min以上，弃沉淀，将得到的上清液用砂芯漏斗过滤后，加入1/10滤液体积的0.1mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.4，4℃预冷1小时，缓慢加入 0.277g/mL硫酸铵至硫酸铵终浓度为45％，4℃静置2h以上，然后4℃ 12000r/min离心30min，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10的0.01mol/L 磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，用0.01mol/L磷酸盐缓冲液透析，将充分透析好的蛋白溶液加入等体积甘油，置-20℃冰箱中备用；

醋酸盐缓冲液：0.29g醋酸钠加入0.141mL醋酸，纯水定容至100mL；

0.1mol/L磷酸盐缓冲液：0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容至100mL。

0.01mol/L磷酸盐缓冲液：用纯水将0.1mol/L磷酸盐缓冲液稀释10倍。