[发明专利]一种分子伴侣共表达提高海藻糖合酶基因表达水平的方法

权利要求书

1.一种分子伴侣共表达提高海藻糖合酶基因表达水平的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)嗜热细菌(Thermus thermophilus)HB27海藻糖合酶基因编码区的克隆及其在大肠杆菌Rosetta(DE3)中的表达

将嗜热细菌总DNA根据已知的海藻糖合酶基因编码区序列，设计一对上下游引物，设计的引物为：上游引物22tttreSNcoF：5’-GGGAAACCATGGGTGGACCCCCTCTGGTACAAG-3’,22tttreSSalR：5’-GGGAAAGTCGACGGCTTTTCCGGCCTTGGC-3’；

PCR反应体系为50μL：嗜热细菌基因组模板DNA 1μL，上下游引物各2μL，dNTP Mix 3μL，2×PrimeSTAR GC Buffering 25μL，DMSO 0.75μL，ddH₂O 15.65μL，PrimeSTAR 0.6μL；PCR反应条件为98℃预变性1min，进行98℃12s，65℃10s，72℃2min54s，共9个循环，然后进行98℃12s，57℃30s，72℃2min54s，共21个循环，最后72℃延伸3min；切胶回收PCR产物并将其克隆至pET-22b上；对所获得的海藻糖合酶进行测序，构建pET-22b-tttreS质粒并实现其在大肠杆菌中的表达；

(2)分子伴侣sigma32，GroeL，GroeS，DnaK和DnaJ基因的克隆及pCS27-sigma32，pCS27-GroeL-GroeS，pCS27-DnaK-DnaJ，pCS27-sigma32-GroeL-GroeS，pCS27-sigma32-DnaK-DnaJ，pCS27-GroeL-GroeS-DnaK-DnaJ和pCS27-sigma32-GroeL-GroeS-DnaK-DnaJ重组质粒的构建；

(3)共表达分子伴侣sigma32、GroeL、GroeS、DnaK和DnaJ诱导表达海藻糖合酶

分别将pET-22b-tttreS和pCS27-sigma32、pCS27-GroeL-GroeS、pCS27-DnaK-DnaJ、pCS27-sigma32-GroeL-GroeS、pCS27-sigma32-DnaK-DnaJ、pCS27-GroeL-GroeS-DnaK-DnaJ、pCS27-sigma32-GroeL-GroeS-DnaK-DnaJ转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中，诱导表达海藻糖合酶。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤(3)中，使用的七种分子伴侣为pCS27-sigma32、pCS27-GroeL-GroeS、pCS27-DnaK-DnaJ、pCS27-sigma32-GroeL-GroeS、pCS27-sigma32-DnaK-DnaJ、pCS27-GroeL-GroeS-DnaK-DnaJ和pCS27-sigma32-GroeL-GroeS-DnaK-DnaJ，表达条件是：诱导时间10～50h，诱导温度4～16℃，诱导剂IPTG终浓度为0～1.0mM/L。