[发明专利]检测食品中沙门氏菌的有扩增内标的PCR方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测食品中沙门氏菌的有扩增内标的PCR方法及试剂盒。

背景技术

沙门氏菌引起的沙门氏菌病是公共卫生学上具有重要意义的人畜共患病之一，是常见、多发、危害较大的细菌性食源性疾病。一些国家沙门氏菌引起的食源性疾病占细菌性食源性疾病总数的40％-60％。我国每年都有很多沙门氏菌引起的食源性疾病的发生，严重地危害人民群众的食品安全与身体健康。沙门氏菌除可感染人外，还可感染很多动物。人畜感染后均可呈无症状带菌状态，也可表现为有临床症状的致死性疾病，它可能加重病态或死亡率，或者降低动物的繁殖生产力，造成极大的经济损失。因此，沙门氏菌在食品安全上具有非常重要的地位，受到普遍的重视。

目前，沙门氏菌检测方法主要有培养法、实时荧光定量PCR(real-time PCR)方法、环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)方法和酶联免疫吸附方法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)等。目前，沙门氏菌的国家标准检测方法(GB4789.4-2010)是培养法，培养法采集样品后，先增菌培养8-18h，再用不同的培养基进行增菌培养，再挑取可疑菌落进行生化鉴定或者运用全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定；其缺点是：培养周期长，需要60h以上，费时费力，而且对于仍然具有致病性的“活的非可培养状态”(Viable But Non-Culturable，VBNC)的细菌敏感性较低，可导致检测结果呈假阴性，尤其是冷冻食品假阴性率非常高，造成极大的食品安全隐患。Real-time PCR方法和全自动微生物生化鉴定系统所用试剂和仪器都较昂贵，而且对操作人员的要求较高，尤其对于大批量样品的检测成本非常高，常规实验室难以接受；而且Real-time PCR和LAMP方法可能因为样品存在对酶活性具有抑制作用的物质而导致结果呈现假阴性；LAMP方法敏感性高，但非常容易造成气溶胶污染，产生假阳性，造成检测结果错误；ELISA免疫学方法操作复杂，费时费力且不便于标准化及高通量操作。

发明内容

鉴于上述各种方法的不足，本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种检测周期短、敏感性高、特异性强、操作简单、成本低廉、可准确地检测食品中沙门氏菌的试剂盒及方法，可在1d之内得到结果，同时无需昂贵的仪器和复杂的试剂，避免因为样品存在DNA聚合酶的抑制因子而得到假阴性结果，可用于多种食品中沙门氏菌的检测等。

本发明的技术解决方案是：

一种检测食品中沙门氏菌的试剂盒，

该试剂盒包含：无菌去离子水，聚合酶链反应PCR反应预混液，对照品；

所述PCR反应预混液含有PCR反应缓冲液，MgCl2，脱氧核糖核苷三磷酸，检测用引物，Taq DNA聚合酶，DNA染料；

所述检测用引物为如下4条引物的混合物：

salF：GGAACGAACTAATTCAGCGATA；

salR：AGATGTCATTAACCTTGTGGAG；

27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG；

1492R：TACGGYTACCTTGTTACGACTT；

所述对照品分为阴性对照品和阳性对照品，阴性对照品为无菌去离子水，阳性对照品为salF/salR和27F/1492R两对引物的扩增产物经凝胶电泳纯化回收得到的DNA片段。

一种检测食品中沙门氏菌的扩增内标PCR方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：

(a)样品的采集：无菌采集可疑食品；

(b)增菌培养：将采集的可疑食品混合均匀后无菌取样25g，放入无菌研钵、组织研磨器内研磨碎或放入均质袋内均质2min，加入无菌的营养肉汤培养基225ml，37±1℃振荡培养6-8h，得增菌液；

(c)DNA提取：取培养后的增菌液，振荡混匀，取1.5ml于离心管中1000rpm离心1min，除去较大块的食品碎片，取上清10000rpm离心10min，除去上清液，用无菌去离子水重悬、洗涤沉淀，10000rpm离心10min，弃上清，用少量无菌去离子水重悬沉淀，沸水浴5min，冰浴5min，1000rpm离心5min，取上清液，得样品模板DNA；

(d)PCR反应管制备：PCR反应管的制备及PCR反应预混液的融化置于冰上进行；