[发明专利]检测食品中沙门氏菌的有扩增内标的PCR方法及试剂盒

权利要求书

1.一种检测食品中沙门氏菌的试剂盒，其特征是：

该试剂盒包含：无菌去离子水，聚合酶链反应PCR反应预混液，对照品；

所述PCR反应预混液含有PCR反应缓冲液，MgCl₂，脱氧核糖核苷三磷酸，检测用引物，Taq DNA聚合酶，DNA染料；

所述检测用引物为如下4条引物的混合物：

salF：GGAACGAACTAATTCAGCGATA；

salR：AGATGTCATTAACCTTGTGGAG；

27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG；

1492R：TACGGYTACCTTGTTACGACTT；

所述对照品分为阴性对照品和阳性对照品，阴性对照品为无菌去离子水，阳性对照品为salF/salR和27F/1492R两对引物的扩增产物经凝胶电泳纯化回收得到的DNA片段。

2.如权利要求1所述的试剂盒检测食品沙门氏菌的方法，其特征在于：

具体操作步骤是：

(a)样品的采集：无菌采集可疑食品；

(b)增菌培养：将采集的可疑食品混合均匀后无菌取样25g，放入无菌研钵、组织研磨器内研磨碎或放入均质袋内均质2min，加入无菌的营养肉汤培养基225ml，37±1℃振荡培养6-8h，得增菌液；

(c)DNA提取：取培养后的增菌液，振荡混匀，取1.5ml于离心管中1000rpm离心1min，除去较大块的食品碎片，取上清10000rpm离心10min，除去上清液，用无菌去离子水重悬、洗涤沉淀，10000rpm离心10min，弃上清，用少量无菌去离子水重悬沉淀，沸水浴5min，冰浴5min，1000rpm离心5min，取上清液，得样品模板DNA；

(d)PCR反应管制备：PCR反应管的制备及PCR反应预混液的融化置于冰上进行；

依次取PCR反应预混液24ul、样品模板DNA 1ul加入至PCR反应管中混合均匀，制得样品模板DNA的PCR反应管；按样品模板DNA的PCR反应管的制备方法依次制备阴性对照品和阳性对照品的PCR反应管；阴性对照品的PCR反应管中的样品模板DNA用试剂盒中的阴性对照品代替，阳性对照品的PCR反应管中的样品模板DNA用试剂盒中提供的阳性对照品代替；每扩增一次都要至少有一管阴性对照和一管阳性对照；

(e)扩增检测：将制备好的样品模板DNA、阴性对照品、阳性对照品的PCR反应管置于PCR仪上进行PCR扩增，得PCR扩增产物，PCR的具体反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s、53.3℃退火30s、72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸10min；

(f)检测结果判定：取1g琼脂糖溶于100ml电泳缓冲液中，混合均匀后煮沸，冷却，倾倒凝胶板；凝胶冷却凝固后，将PCR扩增产物2-5ul加入凝胶孔中进行电泳；电泳结束后，将凝胶放置于紫外灯下观察，判定结果：①阳性对照的凝胶孔有两条电泳条带而阴性对照的凝胶孔无任何条带，则PCR反应检测成功；②若阳性对照的凝胶孔没有出现条带，则说明提取的DNA中含有抑制PCR反应的因素，建议重新提取DNA后再进行检测；③若阴性对照有2条带，说明PCR反应管制备过程中有交叉污染，结果不可靠，建议重新进行PCR检测；④阳性对照有2条带，阴性对照没有条带，被检样品的凝胶孔只出现1条约1500bp的电泳条带与阳性对照的凝胶孔相应条带大小一致，则结果判断为阴性；⑤被检样品的凝胶孔出现的2条电泳条带与阳性对照的凝胶孔中相应条带大小一致，阴性对照无条带，则判定为被检样品阳性。

3.根据权利要求2所述的检测食品中沙门氏菌的方法，其特征是：所述引物PCR反应体系为PCR反应液24μl、样品模板DNA 1μl。

4.根据权利要求2所述的检测食品中沙门氏菌的方法，其特征是：进行PCR扩增时，具体反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s、53.3℃退火30s、72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸10min。