[发明专利]日本白鲫与团头鲂亚科间远缘杂交的方法和四倍体杂交鱼的应用

权利要求书

1.一种日本白鲫与团头鲂亚科间远缘杂交的方法，其特征在于：所述方法是以日本白鲫为母本，以团头鲂为父本，将性成熟的日本白鲫的卵子与团头鲂的精子进行人工干法受精，受精卵在19℃～20℃水温下孵化，鱼苗在池塘中饲养；再利用流式细胞DNA含量测定法、外周血细胞培养的染色体倍性检测方法和血涂片法对鱼苗进行DNA含量、染色体数目以及血细胞大小的检测，筛选后制备得到三倍体杂交鱼和四倍体杂交鱼。

2.根据权利要求1所述的日本白鲫与团头鲂亚科间远缘杂交的方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：

(1)亲鱼的选择和培育：在繁殖期前3～4个月，挑选性成熟特征明显、体征良好的雌性日本白鲫和雄性团头鲂分别作为远缘杂交的母本亲鱼和父本亲鱼进行专池培育，保持水质良好；在繁殖期前一个月左右以精饵饲养，每隔2～3天流水刺激一次，以促进亲鱼性腺发育成熟；

(2)人工催产：在当年的5月中旬至6月上旬，当水温稳定在20℃以上时，为亲鱼注射黄体素释放激素类似物与绒毛膜促性腺激素的混合催产剂进行催产，所述黄体素释放激素类似物的用量为10μg/kg，绒毛膜促性腺激素的用量为600IU/kg；先注射母本亲鱼，4～5h后再注射父本亲鱼，父本亲鱼的注射剂量减半；注射完毕后按1∶6～8的数量比将母、父本亲鱼放入同一产卵池中，然后视水情及时向池中冲水；在产卵前3～4h，注入一定水量后，停止注水，让鱼在静水中催产，直至其开始顺利产卵和产精；

(3)授精孵化：挑选产卵顺利的母本亲鱼，然后与产精量大的父本亲鱼进行人工干法授精，受精卵置于水温为19℃～20℃的培养皿中静水孵化；

(4)饲养：待鱼苗全部孵出后，于孵化环道中继续培育2～3天，待鱼苗出现腰点后将鱼苗转入预先培肥的池塘中饲养，1～2天后泼洒豆浆，2～3次/天；再利用流式细胞DNA含量测定法、外周血细胞培养的染色体倍性检测方法和血涂片法对鱼苗进行DNA含量、染色体数目以及血细胞大小的检测，筛选后制备得到三倍体杂交鱼和四倍体杂交鱼。

3.根据权利要求2所述的日本白鲫与团头鲂亚科间远缘杂交的方法，其特征在于，所述步骤(2)中注射时采用胸鳍基部无鳞处腹腔一针注射法。

4.根据权利要求2所述的日本白鲫与团头鲂亚科间远缘杂交的方法，其特征在于，所述步骤(3)中授精孵化时是用帆布担架固定母本亲鱼与父本亲鱼进行人工干法授精。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的日本白鲫与团头鲂亚科间远缘杂交的方法，其特征在于，所述流式细胞DNA含量测定法包括以下操作步骤：用经肝素润湿的一次性注射器从鱼尾静脉血管采血0.2mL，注入装有0.8％生理盐水的Eppendorf管中，在血液和生理盐水混合液中加入1mL细胞核提取液DAPI-A，处理时间10～15min；样品经过20μm尼龙滤器过滤；DNA染色液静置于暗处染色样品5～10min，然后上机检测。

6.根据权利要求1～4中任一项所述的日本白鲫与团头鲂亚科间远缘杂交的方法，其特征在于，所述外周血细胞培养的染色体倍性检测方法包括以下操作步骤：1)在超净工作台中配制培养基，100ml培养基含以下成分：84ml RPMI-1640，15ml小牛血清，2支PHA，1ml0.1％肝素钠，以7.5％NaHCO₃或1N HCl调pH至7.2～7.4；2)用注射器吸取灭菌肝素钠溶液，于用碘酒消毒后的实验鱼尾部静脉取血；3)按每10ml培养液中加入0.2ml抗凝血的标准将抗凝血加入培养液中，于24℃、5％二氧化碳浓度的培养箱中培养68～72小时，培养期间，定期轻摇匀，以使细胞充分接触培养基；4)终止培养前24小时，在培养液中用1ml注射器滴加入10μg/ml的秋水仙碱，使终浓度为0.05～0.07μg/ml。

7.根据权利要求1～4中任一项所述的日本白鲫与团头鲂亚科间远缘杂交的方法，其特征在于，所述血涂片法的操作步骤包括：1)用碘酒棉签擦拭鱼尾静脉部位，用一次性注射器取适量血液，轻推一滴于干净载玻片一端，使血滴附于玻片面上；2)以一只手拿该载玻片的两端，用另一只手拿住另一载玻片的一端，在滴有血液的载玻片上由前向后接触血滴，使两载玻片约成45°角，轻轻移动，使血滴成一直线，然后由前向后推为一均匀的薄片；3)涂片在空气中干燥后置于染色架上，滴加瑞氏染色液，使涂片被染色液覆盖；4)染色5～10分钟后，于载玻片背面用蒸馏水均匀冲洗，见涂片呈粉红色后，自然晾干，最后镜检。

8.一种如权利要求1～7中任一项所述的日本白鲫与团头鲂亚科间远缘杂交的方法获得的四倍体杂交鱼的应用，其特征在于，将所述四倍体杂交鱼通过后续自交选育，形成一个遗传稳定的具有四套白鲫染色体的四倍体鱼品系，并用该四倍体鱼品系作为繁殖不育三倍体鱼的资源。