[发明专利]一种金纳米棒生物复合物及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种电化学免疫分析的方法，确切说，涉及一种利用纳米复合材料建立电化学免疫传感技术，应用于乳制品中大肠杆菌检测的研究，属于电化学分析技术领域。

背景技术

乳制品含有丰富的蛋白质、脂肪等营养物质，在其生产、加工、运输和储存过程中极易受到致病性细菌的污染，从而会影响人们的生活质量和健康水平。各种调查显示，人类通过乳源性途径引起的腹泻、大面积食物中毒与乳制品中大肠杆菌的数量呈现一定的相关性，因此大肠杆菌已经成为评价乳制品卫生质量的重要指标，被世界各国乳制品微生物标准列为必检项目。

目前，对乳制品中大肠杆菌常用的检测方法主要包括：MPN计数、标准平板计数法、Petrifilm^TM测试片计数法等。这些方法虽然在大肠杆菌检测中发挥了很大作用，但存在着耗时长、灵敏度低、操作繁琐等缺点,在一定程度上已经不能满足乳制品生产厂家、监督管理等部门快速检测的需求。比如，MPN计数每种样品都需要经过系列稀释、初发酵、平板分离和复发酵，通常需要3–5天时间才能得到检验结果，一些乳制品企业常因此造成产品库存堆积，极大地限制了产品的上市时间；并且，该方法存在较多影响实验结果准确性的干扰因素，如操作人员分离单个菌落的技术水平、单个菌落的挑选以及革兰氏染色技术等，其技术特点决定了该方法有时还会低估样品中大肠杆菌的数目甚至造成漏检。而且，乳制品成分十分复杂，其它微生物也会干扰检测结果引起假阳性误差。因此，建立乳制品中大肠杆菌的快速、灵敏、准确的检测方法对提高乳制品质量、促进乳制品行业发展、保国安民都具有重大的现实意义。

发明内容

本发明为了满足生物技术发展和乳制品质量安全检测的需求，提出利用纳米复合材料建立电化学免疫分析方法，应用于乳制品中大肠杆菌检测的研究。

为实现以上发明的目的，本发明采用下述技术方案：利用二氧化硅修饰的金纳米棒（AuNRs@SiO₂）作为载体结合检测抗体（_dAb）和二茂铁甲酸（Fc）制备金纳米棒生物复合物（_dAb-AuNR-Fc）。采用“三明治”免疫分析模式构建电化学免疫传感器，并将其应用于乳制品中大肠杆菌的检测研究。

一种_dAb-AuNR-Fc的制备方法，按照下述步骤进行：

（1）AuNRs@SiO₂的制备：首先，根据经典的种子法制备十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）包被的金纳米棒（AuNR-CTAB）。其次，制备AuNRs@SiO₂：将10 mL AuNR-CTAB于9000转/分钟离心10分钟，加入10 mL超纯水重悬，反复2次。在搅拌条件下，向10 mL AuNR-CTAB水溶液中加入100 μL氢氧化钠（0.10 mol/L），然后加入60 μL正硅酸乙酯/3-氨基丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液（体积比：1:1:5），继续搅拌24小时后收集，即得到AuNRs@SiO₂，然后将其用超纯水洗涤并分散于5.0 mL磷酸缓冲溶液（PBS）中，待用；

（2）_dAb-AuNR-Fc的建立：取1.0 mL AuNRs@SiO₂溶液，在搅拌条件下，加入1.0 mL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐/N-羟基琥珀酰亚胺（EDC/NHS，摩尔比：4:1）反应10分钟，然后依次加入10 μL检测抗体（_dAb）（4.0 mg/mL）、1.0 mL二茂铁甲酸（Fc）饱和水溶液，继续搅拌2小时即制得_dAb-AuNR-Fc。将其用超纯水洗涤并分散于1.0 mL PBS中保存于4 °C冰箱。

_dAb-AuNR-Fc生物复合物检测乳制品中大肠杆菌的方法，按照下述步骤进行：