[发明专利]一种荚膜多糖的纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及对细菌性荚膜多糖粗制品的纯化方法。

背景技术

细菌的荚膜是包裹在细菌细胞外的一层黏性物质，主要成分是多糖，是细菌的保护性抗原和毒力因子。随着生物化学技术的广泛应用，可将细菌的荚膜作为有效的抗原成分提取出来，作为制备疫苗的候选抗原。

由于发酵液中存在大量的培养细菌生长过程中代谢产物，为了避免二次污染，保证多糖的稳定性，需要快速的将多糖与细胞残片等杂质分离，往往先制备成粗制品的形式。虽然粗制品能暂时保证多糖的稳定性，但其中成份复杂，各种杂质含量仍然很高。为了满足疫苗制备所必须的荚膜多糖纯度，仍需经过纯化步骤处理，将粗制品中多余的蛋白、核酸、内毒素等杂质去除，从而避免后续接种疫苗可能引起的副反应。

传统荚膜多糖的纯化是以Gotschlich的方法(Gotschlich EC,Liu T Y,Artenstein M S.Human immunity to the meningococcus III.Preparation and immunochemical properties of the group A,group B,and group C meningococcal polysaccharides[J].J Exp Med,1969,129(6):1349)为基础发展起来的。国内最权威的，《中华人民共和国药典》2010版三部中明确指出A群脑膜炎球菌多糖疫苗和伤寒Vi多糖疫苗均采用以下方法进行多糖纯化：多糖粗制品溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液稀释至适宜浓度；按适当比例用冷酚提取数次，离心收集上清液，并用0.1mol/L氯化钙溶液或其他适宜溶液透析或超滤，加入乙醇至终浓度为75％～80％；离心收集的沉淀物用无水乙醇及丙酮分别洗涤，干燥后用灭菌注射用水溶解沉淀物，除菌过滤后即为多糖原液。国内疫苗生产厂家多采用此法进行荚膜多糖的纯化，如23价肺炎链球菌荚膜多糖疫苗的研制采用方法大致流程如下：粗制粗糖按1:2用冷酚抽提去蛋白，乙醇沉淀多糖后用无水乙醇、丙酮洗涤多糖(杨耀,栗克喜等.23价肺炎链球菌荚膜多糖疫苗的研制.中国生物制品学杂质,2000,13(3):154-156)(韩菲,曹欣等.23价肺炎链球菌荚膜多糖疫苗的研制.国际生物制品学杂质,2010,33(3):134-138)。

国内对细菌荚膜多糖的纯化工艺一直沿用传统的酚抽提法，该方法需要较长的离心时间，且苯酚作为有一种具有极强腐蚀的试剂，可能腐蚀操作者的皮肤、粘膜甚至抑制操作者的中枢神经或损害肝、肾功能；且废弃苯酚的处理，对环境保护来说存在着较严重的威胁。因此，开发出来新的、有效的、环保的荚膜多糖纯化工艺是我们所关注的。

美国专利US004686102、US5714354中分别公开了23价肺炎多糖疫苗的制备方法，绝大多数型别使用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)去除来沉淀肺炎荚膜多糖，US004686102仍需增加活性炭和多步乙醇沉淀的方法，US5714354需活性炭、羟基磷灰石、阴离子交换来纯化多糖，才能获得核酸、蛋白指标满足疫苗制备的要求。其步骤繁琐，很大程度上影响荚膜多糖的回收率。

专利US5847112提到对于可采用离子交换的方法获得纯度较高的精糖，但对于粗制品的处理是用核酸和蛋白酶的方法来控制最终多糖中核酸、蛋白的含量。专利CN 102653565 A中提到用CTAB结合超滤、乙醇沉淀的方法能将核酸、蛋白含量控制在很低的水平，但同样在粗制品部分添加了蛋白酶处理的。我们知道如果制品添加了额外的核酸酶、蛋白酶，为了避免外源因子的污染，将会增加后续纯化的负担，同时仍需对最终产品中的残留量进行控制；且酶的成本昂贵、处理量小，不适合规模化的使用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术纯化荚膜多糖需增加加多试剂、工艺复杂或增加有害苯酚、丙酮等有毒有害试剂、对操作人员健康带来危害，造成环境污染，或添加额外的、成本昂贵的蛋白酶或核酸酶、增加后续纯化的负担的缺陷和不足，其目的是提供一种不论粗制品中杂质成分有多复杂，杂质含量有高，均能纯化出安全性较高的、符合标准或优于标准的、工艺简便的、适合于产业化的荚膜多糖纯化新方法。

本发明所述的新方法的技术方案如下：

1.一种荚膜多糖的纯化方法，包括以下步骤：