[发明专利]一种利用TALEN系统定点突变RNase ZS1培育水稻温敏不育系的方法

说明书

本发明公开了一种利用TALEN系统定点突变RNase Z^S1培育水稻温敏不育系的方法，其包括靶标序列设计；将左、右侧TALE识别序列转化成识别模块；构建含识别模块的TALEN载体；合成含TALEN‑L和TALEN‑R的双元载体；遗传转化获得阳性转基因植株；选择阳性转基因植株中获得突变的植株；将突变的植株传代种植和分离，获得不带转基因成分但低温下育性恢复可育的植株作为温敏不育株等步骤。通过TALEN系统定点突变失活RNase Z^S1蛋白的活性，实现人工培育可以获得不带转基因成分的温敏不育系，具有目的性强，基因组损伤小，规避了转基因带来的可能风险。

技术领域

本发明涉及水稻温敏不育系的培育方法，具体涉及一种利用TALEN系统定点突变RNase Z^S1培育水稻温敏不育系的方法。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)是最主要的粮食作物，全世界超过一半的人口以水稻为主食。随着人口的增长以及可耕地面积的减少，粮食的供需不平衡变得日益显著，增加粮食单位面积产量是解决粮食供需不平衡的主要措施之一。幸运的是，杂交水稻可以比常规水稻提高20-30％的产量，在解决粮食不足的问题上起到了非常重要的作用，因此，杂交水稻的种植面积稳步上升，现在大约占水稻种植面积的60％左右。

根据所使用的不育系类型的不同可以将杂交水稻育种的方法分为两系法和三系法。三系法使用细胞质雄性不育系和恢复系生产杂种F₁代种子，通过保持系和细胞质雄性不育系杂交繁殖细胞质雄性不育系；但是可以作为恢复系的水稻品种在常规水稻中大约只占5％，这大大降低了恢复系和不育系间的遗传多样性，限制了杂种优势的利用。而两系法主要用光/温敏雄性核不育系作为不育系和保持系，因为光/温敏不育系育性受光周期和温度调控，在不育条件下可作为不育系，在可育条件下可作为保持系，一系两用。而且因为不受核质互作影响，几乎所有的正常品种都是可以作为恢复系的。基于这些本质上的差异，两系法杂交水稻技术具有更为广泛的恢复系，不需要利用特殊的恢复基因，使得组合配制更加自由，有利于亚种间杂种优势的利用，对提高杂交水稻组合的米质、产量、抗性等存在更大的潜在优势；光/温敏不育系可一系两用，不需要保持系，简化生产程序；温敏不育性受核基因控制，与细胞质无关，丰富了细胞质遗传的多样性，避免了三系杂交稻不育细胞质的负效应以及细胞质单一可能带来的潜在危险。因此温敏不育系在杂交水稻育种中存在巨大潜力，相比而言，目前在两系杂交水稻育种中广泛应用的为温敏不育系。

安农S-1温敏不育系是第一个被发现的籼型温敏不育突变体，温敏不育材料往往通过自然突变或人工诱变获得，但是突变频率非常低，而利用传统育种手段将突变获得的温敏不育材料培育成为温敏不育系需要漫长的过程，提高温敏不育系的培育效率缩短培育进程已经成为迫切需要解决的关键问题。因此必须使用遗传工程手段，突破传统育种的局限。尽管，RNAi和反义RNA技术可实现对靶基因的抑制表达，但是并不能彻底去除基因的功能，基因残留的功能往往会提高转基因植株的不育起点温度，不利于育种的安全，而且这些转基因植株中不可避免的会残留外源序列，涉及转基因食品安全问题。最近，靶向突变技术取得了突破性进展，已广泛应用于各类生物中。这些方法都是通过特异的靶识别序列或引导序列将核酸内切酶引导到靶标位置，然后核酸内切酶切割靶标DNA，在细胞自身修复系统的帮助下将切断的DNA修复链接起来，但是在修复过程中经常会导致碱基丢失或增加。目前，虽然已经通过RNAi技术干涉 RNase Z^S1，获得温敏不育植株；但是RNAi技术只是部分降低了RNase Z^S1的表达量，并不能使其彻底失活，使得转基因植株的不育起点温度较高，并且不育起点温度不稳定，影响制种安全。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种利利用TALEN系统定点突变RNase Z^S1培育水稻温敏不育系的方法，通过TALEN系统定点突变失活RNase Z^S1蛋白的活性，获得人工培育不带转基因成分的实用型温敏不育系，具有目的性强，基因组损伤小，规避了转基因带来的可能风险。