[发明专利]一种利用TALEN系统定点突变RNase ZS1培育水稻温敏不育系的方法

权利要求书

1. 一种利用TALEN系统定点突变RNase Z^S1培育水稻温敏不育系的方法，其包括以下步骤：

1）靶标序列设计：

根据RNase Z^S1在水稻的Os02g0214300编码区分别设计左侧TALE识别序列、右侧TALE识别序列；左侧TALE识别序列、右侧TALE识别序列间隔13-22碱基；识别序列长度为16-20个碱基；

左侧TALE识别序列Target-TMS5-1L，序列为SEQ ID NO.1：CGGCCGAAGGCGAAGGC，位于Os02g0214300编码区的61-77；

右侧TALE识别序列Target-TMS5-1R，序列为SEQ ID NO.2：CCACGGGGTAGCCCTC，位于Os02g0214300编码区的94-109；

或，左侧TALE识别序列Target-TMS5-2L，序列为SEQ ID NO.10：CACCGTCGAGGGCTAC，位于Os02g0214300编码区的87-102；

右侧TALE识别序列Target-TMS5-2R，序列为SEQ ID NO.11：CTCCTGCCCGCCGAT，位于Os02g0214300编码区的121-135；

2）将左、右侧TALE识别序列转化成识别模块：根据TALE蛋白RVD区的碱基识别原则，将左、右两侧TALE识别序列转化成识别模块；

3）构建含上述步骤2）识别模块的TALEN-L和TALEN-R载体；

4）合成含TALEN-L和TALEN-R的双元载体；

5）遗传转化获得阳性转基因植株；

6）筛选阳性转基因植株中获得突变的植株；

7）上述突变的植株传代种植，获得不带转基因成分且育性恢复可育的植株作为温敏不育株。

2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3）中，含上述步骤2）识别模块的TALEN载体为：首先合成与识别模块每一个碱基对应的TAL识别模块，按照识别序列将所述TAL识别模块聚合，然后分别将两个聚合的TALE模块链接到内切核酸酶Fok I的N-末端，形成能特异性剪切DNA序列的内切核酸酶TALEN；经酶切和测序获得阳性质粒；分别形成TALEN- L和TALEN- R。

3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤4）中，合成含TALEN-L和TALEN-R的双元载体的步骤为：将TALEN- L和TALEN- R载体中的TALEN表达盒切割下来链接到同一个双元载体中，形成TALEN双元载体。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤5）具体为：将TALEN双元载体通过根癌农杆菌介导的遗传转化或基因枪法转化水稻愈伤组织；经筛选，分化和生根成苗，将转基因植株种植于网室，通过潮霉素鉴定并收集阳性转基因植株。

5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤6）具体为：提取T₀代阳性转基因植株的DNA，用引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6对DNA进行扩增，产物经纯化后送公司测序，测序结果与转基因前的野生型植株序列比较，获得突变成功的植株。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤7）具体为：收获T₀代实现定点突变的植株的种子，在长日/高温条件下种植T₁代植株，通过花粉育性观察和潮霉素阳性检测分离不带转基因成分且表型不育的植株种植于短日/低温条件下，育性恢复可育的植株作为温敏不育株，经繁殖后获得温敏不育系。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤6）所述突变的植株为识别序列间碱基缺失或碱基插入或碱基替换的植株。