[发明专利]一种基于发根农杆菌介导的板栗转基因方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及植物转基因技术，主要涉及一种基于发根农杆菌介导的板栗转基因方法。

背景技术

板栗是世界重要的干果类果树之一。目前，在国内，对板栗的研究多集中于生理生化水平，如果实品质分析等，而关于基因挖掘与功能分析的报道较少；其次对板栗地上部分的研究较多，如花芽分化等，而对根系的研究较少。对于板栗关键生物学性状的研究，基因挖掘与功能验证起着不可或缺的作用，而在中国板栗中，转基因体系还未建立，基于转基因体系的基因功能验证还未见报道。目前缺少一套稳定高效的转基因体系，已经成为制约板栗分子生物学研究的瓶颈。

根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)和发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)均是革兰氏阴性土壤细菌,分别应用其Ti质粒和Ri质粒侵染植物伤口进入细胞,并将其上含有的一段T-DNA插入到植物基因组中(Zhou,2010；Cheng,2011)，发根农杆菌Ri质粒的T-DNA上有rol A-D基因群,T-DNA有tms基因,能诱发被感染植物的受伤部位产生大量的毛状根,且Ri质粒T-DNA上的基因不影响植株的再生,转化效率高,目前已在甘草(Glycyrrhizauralensis Fisch.)、烟草(NicotianatabacumL.)等中获得成功。发根农杆菌诱导的毛状根属于激素自养型，具有有效成分含量高、生理生化和遗传性稳定、易于进行操作控制等特点，且所诱导的毛状根可从形态水平上鉴定，根多丛生、多分枝、多根毛，且无向地性，这些都可与未转化的根区别开。

目前，板栗转基因还未见报道，因此，对于板栗的遗传改良和基因挖掘与功能分析，建立一套农杆菌介导的、高效稳定的转基因技术是很必要的。本发明的目的在于利用发根农杆菌建立‘燕山板栗’毛状根诱导体系，从而提供一种基于发根农杆菌介导的转基因方法。

发明内容

本发明可以提供一种发根农杆菌介导的转基因方法，获得‘燕山板栗’毛状根。

本发明所提出的技术方案包括以下步骤：

(1)制备板栗无菌苗；

(2)发根农杆菌活化，将发根农杆菌在LB固体培养基上划线，以获得单菌落，挑取单菌落于LB液体培养基上，经暗培养；

(3)侵染外植体，将板栗无菌苗下胚轴切除，在伤口处涂抹已活化的发根农杆菌，然后将其放在共培养基上，经光照培养；

(4)共培养；

(5)发根培养；

(6)荧光检测。

进一步地，其中所述的发根农杆菌为MSU440，载体上具35S：：DsRed报告基因。

进一步地，其中步骤(2)中LB固体培养基或者LB液体培养基含50～100mg/L壮观霉素(spectinomycin)。

进一步地，其中步骤(2)中将发根农杆菌在LB固体培养基上划线，经28±2℃暗处倒置培养48－72h后获得单菌落。

进一步地，其中步骤(2)中所述的暗培养系经28±2℃、摇床转速200±20rpm暗培养48h。

进一步地，其中步骤(3)还包括用沾有农杆菌的针头在板栗无菌苗胚根的伤口及伤口周围，然后将其放在铺有1/2无菌滤纸的共培养培养基上，Parafilm膜封口2/3。

进一步地，其中步骤(4)的共培养系经21±2℃光照16h、暗培养8h，如此反复培养5d。

进一步地，其中步骤(1)包括剥取‘燕山红栗’果实种子，清水冲洗干净后用70-75％乙醇消毒2±1min，然后3-4％次氯酸钠消毒15-20min，灭菌蒸馏水漂洗3次以上，接种于木本植物基础培养基(WPM培养基)，25±2℃暗培养2－3d获得无菌苗。

进一步地，其中步骤(5)的继代培养包括将浸染后的外植体从共培养培养基上更换到发根培养基上，Parafilm膜全封口，24℃～25℃光照16h，暗培养8h,如此反复培养25d，每周更换一次培养基。

进一步地，其中步骤(6)包括采用体视荧光显微镜对共转化植株进行荧光观察。

本发明通过发根农杆菌介导的转基因技术，可在短时间内(1个月)得到毛状根，节约研究时间，并且转化效率较高，可达60％左右(阳性植株总数占总侵染植株总数的百分比)。

具体实施方法：

现在结合具体实施例，进一步对本发明各步骤进行详细描述：

1、含35S：：DsRed报告体系的表达载体MSU440发根农杆菌：由瓦赫宁根大学Ton Bisseling课题组馈赠。