[发明专利]一种基于发根农杆菌介导的板栗转基因方法

权利要求书

1.一种发根农杆菌介导的板栗转基因方法，其特征在于，包括以下步骤：

制备板栗无菌苗；

发根农杆菌活化，将发根农杆菌在LB固体培养基上划线，以获得单菌落，挑取单菌落于LB液体培养基上，经暗培养；

侵染外植体，将板栗无菌苗下胚轴切除，在伤口处涂抹已活化的发根农杆菌，然后将其放在共培养基上，经光照培养；

共培养；

发根培养；

荧光检测。

2.根据权利要求1所述的发根农杆菌介导的板栗转基因方法，其中所述的发根农杆菌为MSU440，载体上具35S：：DsRed报告基因。

3.根据权利要求1所述的发根农杆菌介导的板栗转基因方法，其中步骤（2）中LB固体培养基或者LB液体培养基含50～100mg/L壮观霉素（spectinomycin）。

4.根据权利要求1或3中所述的发根农杆菌介导的板栗转基因方法，其中步骤（2）中将发根农杆菌在LB固体培养基上划线，经28±2℃暗处倒置培养48－72h后获得单菌落。

5.根据权利要求1或3中所述的发根农杆菌介导的板栗转基因方法，其中步骤（2）中所述的暗培养系经28±2℃、摇床转速200±20rpm暗培养48h。

6.根据权利要求1所述的发根农杆菌介导的板栗转基因方法，其中步骤（3）还包括用沾有农杆菌的针头在板栗无菌苗胚根的伤口及伤口周围多次刺穿，然后将其放在铺有1/2无菌滤纸的共培养培养基上，Parafilm膜封口2/3。

7.根据权利要求1所述的发根农杆菌介导的板栗转基因方法，其中步骤（4）的共培养系经21±2℃光照16h、暗培养8h，如此反复培养5d。

8.根据权利要求1所述的发根农杆菌介导的板栗转基因方法，其中步骤（1）包括剥取‘燕山红栗’果实种子，清水冲洗干净后用70-75%乙醇消毒2±1min，然后3-4%次氯酸钠消毒15-20min，灭菌蒸馏水漂洗3次以上，接种于木本植物基础培养基（WPM培养基），25±2℃暗培养2－3d获得无菌苗。

9.根据权利要求1所述的发根农杆菌介导的板栗转基因方法，其中步骤（5）的发根培养包括将浸染后的外植体从共培养培养基上更换到发根培养基上，Parafilm膜全封口，24℃～25℃光照16h，暗培养8h,如此反复培养25d，每周更换一次培养基。

10.根据权利要求1所述的发根农杆菌介导的板栗转基因方法，其中步骤（6）包括采用体视荧光显微镜对共转化植株进行荧光观察。