[发明专利]基于高分辨透射电子显微学的单分子DNA测序方法

说明书

技术领域

本发明涉及基于高分辨透射电子显微学的单分子DNA测序方法。

背景技术

2002年，通过六个国家超过十年的合作研究，人类获得了第一组人类遗传物质——DNA序列图谱，这宣布了人类正式迈向后基因组时代。人类自身DNA序列图谱的测定，对于健康预测、疾病诊断、个体化医疗等领域具有其余技术不可替代的作用，即将对人类的生存和繁衍产生愈来愈广泛和深远的影响。

到2014年为止，DNA序列检测技术(简称测序)的发展历程大致可以分为三代。第一代测序技术基于Sanger化学终止法和大规模克隆技术，其优点是准确率高，但其效率极其低下、成本巨大；第二代测序技术基于鸟枪片段化法、短序列拼接的生物信息学技术，其优点是效率显著提高，成本也下降了几个数量级，但因其仍然需要大规模的DNA复制，成本非普通人可以负担，而且短序列的拼接准确率不够高，因此第二代测序技术仍然无法满足让每个人类个体都拥有自己DNA序列数据的需求。第三代测序技术，又称单分子测序技术，以纳米孔测序技术为代表。其特点是，彻底放弃DNA复制的过程，实现单拷贝DNA序列直接读取，因此理论上在速度和成本方面都可以满足个体DNA测序的需求。然而，第三代测序技术难度极高，发展至今遇到了理论和实验上的诸多瓶颈。例如，DNA过孔速度为随机过程，无法控制纳米孔的俘获率和过孔速度，造成了无法识别单碱基携带的信息；此外，纳米孔的制备过程成本仍然极高、费时、至今尚不具备规模化生产条件。目前为止，还没有仅仅使用第三代技术完成过人类基因组的测序的相关报道。

由此可见，基因测序发展的关键，在于节省成本、提高效率。而实现这一目的的技术途径，是必须放弃大规模扩增的方法。换言之，只有单分子(单拷贝)的测序技术，才是真正能够实现低成本、普及化的人类个性化测序技术。但虽然历经二十余年发展，基因测序技术目前仍无法走进普通人的生活，原因也就在于单分子测序技术还没有突破其技术瓶颈，走向实用。因此，我们亟需在前人的基础上发展一种相对简易可行，成本适中的单分子测序方法。

透射电子显微技术(TEM)是以高压加速电子作为成像源，对纳米尺度的样品进行高分辨成像和成分分析的技术。TEM发展至今，其信息分辨率普遍已经优于0.24纳米，小于DNA相邻碱基之间的距离(0.34nm)。装备有球差(Cs)校正装置的TEM，分辨率更可以达到0.05-0.08nm，足以对单原子进行成像。随着Cs-TEM技术的不断完善和成本的持续降低，我们有理由相信，基于单原子标记的超高分辨TEM的单分子DNA直读测序技术将成为一种简单可行、成本适中的单分子测序技术。

单个原子标记是一种湿法化学标记法。标记物三个维度的尺寸都在1纳米以下，仅有单个或数个原子构成，外观恰似一极小的点状物，其内部电子在各方向上的运动都受到局限，所以量子局限效应(quantum confinement effect)特别显著。由于单原子尺寸小，单分散性好，尤其适合进行DNA等生物样品标记，由于重金属化学元素的原子序数和晶体结构都具有明显差异，在超高分辨透射电镜之中易于以衍射衬度、Z-衬度的成像模式予以分辨，因此单原子标记方法特别适合用于DNA序列在高分辨TEM中的标记成像。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的不足，本发明目的是提供了一种基于高分辨透射电子显微学的单分子DNA测序方法，使用不同的重元素单原子对单链DNA进行单原子标记；再发展透射电子显微镜(TEM)技术，对标记物-DNA复合物进行高分辨成像，实现DNA序列在TEM中的直接可读化。

技术方案：为实现上述发明的目的，本发明采用的技术方案是：一种基于高分辨透射电子显微学的单分子DNA测序方法，所述测序方法是通过使用重元素标记物的单个原子或少量原子对核酸单拷贝序列进行标记，并采用高分辨透射电子显微镜进行成像和结果分析。

其中，上述核酸单拷贝是指直接从生物细胞或组织中分离纯化所得的核酸产物；核酸单拷贝制备方法请见F.M.奥斯伯等主编《精编分子生物学实验指南(第四版)》科学出版社2005年第一版。

其中，上述重元素标记物为金、银、铂、钨、汞、铅、铀或具有高原子序数的常见金属及其无机或有机化合物、复合物、螯合物。

其中，上述重元素标记物的三维特征尺寸小于1纳米，即仅由单原子或数个原子组成，并能够与不同类型的碱基进行特异性结合。

其中，上述测序方法通过使用高分辨透射电子显微镜的明场、暗场、扫描透射法、高角环形暗场、电子特征X射线能谱、电子能量损失谱、能量过滤成像技术中的一种或两种以上技术的组合体进行成像分析。